загрузка...

Определение N-метилникотинамида в моче по Хуффу и Перлцвейгу

Принцип метода. N-метилникотинамид в щелочной среде конденсируется с ацетоном, образуя вещество с ярко-зеленой флюоресценцией, переходящее под действием кислоты в устойчивое соединение с синей флюоресценцией.

Реактивы.

1. М раствор гидроксида натрия (NaOH), свободного от карбонатов: готовят соответствующим разведением из более концентрированного 12 М раствора. Емкости с раствором закрывают пробками с поглотительными трубками, заполненными натронной известью.

2. М раствор соляной кислоты: концентрированную кислоту с относительной плотностью 1,26 разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.

3. Ацетон: для очистки от флюоресцирующих примесей подвергают перегонке или обрабатывают активированным древесным углем.

4. 20% раствор дигидрофосфата калия (КН2РО4). Г отовят в день исследования.

5. Основной стандартный раствор N-метилникотинамида: 10 мг N-

метилникотинамида вносят в мерную колбу на 100 мл, .растворяют в 40-50 мл 0,1 М раствора соляной кислоты, доводят объем до метки. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Стандартный раствор пригоден в течение 4-6 мес.

6. Рабочие стандартные растворы с содержанием 2 и 4 мкг в 1 мл: готовят разведением соответственно 2 и 4 мл основного стандартного раствора в мерных колбах на 100 мл М раствором соляной кислоты.

Ход определения.

Мочу разводят в 10 раз: к 1 мл мочи прибавляют 9 мл дистиллированной воды.

В две химические пробирки (лучше градуированные на 10 мл) отбирают по 1 мл разведенной мочи.

В одну из пробирок добавляют 0,5 мл ацетона (опыт - “О”), в другую - 0,5 мл дистиллированной воды (контроль на посторонние флюоресцирующие вещества - “К”). Пробирки встряхивают.

В обе пробирки (“О” и “К”) быстро добавляют по 0,2 мл 6 М раствора гидроксида натрия, стараясь внести его непосредственно в содержимое пробирки, перемешивают и оставляют стоять 5 мин.

Затем прибавляют по 0,3 мл 6 М раствора соляной кислоты, перемешивают и помещают обе пробирки в кипящую водяную баню на 2 мин.

Охлаждают, добавляют в обе пробирки по 1 мл свежеприготовленного 20% раствора дигидрофосфата калия и 7 мл дистиллированной воды (до объема 10 мл), встряхивают после добавления каждого реактива.

Одновременно с пробами мочи обрабатывают стандартные растворы (“Сг”) и контроль на реактивы (“Кст”). Для этого отмеривают в пробирки по 1 мл рабочего стандартного раствора, содержащего соответственно 2 и 4 мкг в 1 мл. В контрольную пробирку вносят 1,0 мл дистиллированной воды. Во все пробирки наливают по 0,5 мл ацетона, встряхивают, затем прибавляют струей, направленной точно в содержимое пробирки, по 0,2 мл 6 М раствора гидроксида натрия. Дальше обработку ведут так же, как и опытных проб.

Флюоресценцию измеряют на флюориметре с первичным и вторичными фильтрами для фолиевой кислоты.

Расчет содержания N-метилникотинамида в суточном объеме мочи проводят по формуле:

Сст х (О - К) xV ах1000

X - содержание N-метилникотинамида в суточной моче, мг;

Сст - концентрация N-метилникотинамида в стандартном растворе, мкг/мл;

О - показание флюориметра для опытной пробы;

К - показание флюориметра для контрольной пробы; а - показание флюориметра для стандартной пробы (за вычетом контроля на реактивы);

1000 - коэффициент пересчета в миллиграммы;

V - суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания N-метилникотинамида в моче из мг/сут в мкмоль/сут - 7,29.

В норме за сутки выделяется 51,3-87,5 мкмоль (7-12 мг); за час натощак - 2,9-3,6 мкмоль (0,4-0,5 мг).

<< | >>
Источник: Савченко А.А.. Витамины как основа иммунометаболической терапии / А.А. Савченко, Е.Н. Анисимова, А.Г. Борисов, А.Е. Кондаков. - Красноярск: Издательство КрасГМУ2011. 2011

Еще по теме Определение N-метилникотинамида в моче по Хуффу и Перлцвейгу:

  1. Определение 4-пиридоксиловой кислоты в моче по Хуффу и Перлцвейгу
  2. Определение тиамина (витамина Ві) в моче по Вангу и Харрису
  3. Определение рибофлавина (витамина В2) в моче по Е.М. Масленниковой и Л.Г. Г воздовой
  4. Лабораторные методы исследования витаминов. Определение аскорбиновой кислоты в моче по Тильмансу
  5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  7. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
  8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH
  10. Г. Определение точки кипения
  11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА
  12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЙОДНОГО ЧИСЛА
  13. 38.2. Определение понятий
  14. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПГ