загрузка...

Определение рибофлавина (витамина В2) в моче по Е.М. Масленниковой и Л.Г. Г воздовой

Принцип метода. Методика основана на способности раствора рибофлавина давать в ультрафиолетовых лучах яркую желто-зеленую флюоресценцию, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации рибофлавина.

Реактивы.

1. 30% раствор гидроксида натрия (NaOH).

2. 1% раствор гидроксида натрия (NaOH).

3. 20% раствор серной кислоты (H2S04).

4. 1% раствор серной кислоты (Н2 S04).

5. Уксусная кислота ледяная (СН3СООН).

6. 4% раствор перманганата калия (КМпО4).

7. Пергидроль.

8. Бромтимоловый синий.

9. Основной стандартный раствор витамина В2 с содержанием рибофлавина 100 мкг/мл: 10 мг рибофлавина вносят в мерную колбу на 100 мл, приливают 50-60 мл дистиллированной воды. Растворяют при нагревании, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла. Раствор устойчив в течение 2-3 мес.

10. Рабочие стандартные растворы с концентрацией рибофлавина 1, 2, 3, 4 мкг в 1 мл. Готовят перед проведением исследования разведением основного стандартного раствора: 1, 2, 3, 4 мл основного стандартного раствора (абсолютное содержание рибофлавина - 100, 200, 300, 400 мкг соответственно) доводят в мерных колбах до объема 100 мл дистиллированной водой. Хранят в холодильнике. Рабочие стандартные растворы пригодны для работы в течение 4-5 дней.

Ход определения.

Работу рекомендуется проводить при неярком освещении. Для анализа необходимо брать прозрачную мочу. В случае наличия мутности мочу фильтруют.

Подготавливают мочу для контрольного опыта. В коническую колбу на 100 мл или 50 мл вносят 3 мл мочи, добавляют 1 мл 30% раствора гидроксида натрия и 5 мл дистиллированной воды. Ставят на песочную баню

или электрическую плитку с закрытым нагревательным элементом и упаривают пробу до объема 3-4 мл. Витамин В2 при кипячении в щелочной среде разрушается. Пробы охлаждают, затем нейтрализуют 20% раствором серной кислоты. В конце нейтрализации применяют 1% раствор серной кислоты. Окончание нейтрализации устанавливают по индикатору бромтимоловому синему капельным методом или по универсальной индикаторной бумаге. После нейтрализации жидкость переносят в мерный цилиндр на 10 мл. Объем мочи доводят дистиллированной водой до удвоенного объема (если мочи было взято 3 мл, то доводят дистиллированной водой до 6 мл) и после фильтрования (если раствор мутный) в пробирки для контрольного опыта (“К”) отмеряют по 2 мл разведенной мочи, что будет соответствовать 1 мл не разведенной мочи.

В пробирки для определения витамина В2 (“О”) вносят по 1 мл неразведенной мочи из суммарного суточного количества.

Г отовят серию рабочих стандартных растворов с содержанием рибофлавина 1, 2, 3, 4 мкг в 1 мл. В пробирки (“Сг”) вносят по 1 мл каждого раствора стандарта, обрабатывают как опытные пробы. Готовят контроль к стандарту (“Кст” вносят 1 мл дистиллированной воды и обрабатывают как стандарт.

Во все пробирки (“О”, “К”, “Ст”, “Кст”') добавляют дистиллированную воду до объема 6 мл, встряхивают.

В каждую пробирку (“О”, “К”, “Ст”, “Кст”) добавляют по 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, смешивают и приливают по 1,5 мл 4% раствора перманганата калия (КМп04), тщательно перемешивают содержимое. При этом окисляются посторонние флюоресцирующие вещества. Одновременно ведут обработку не более 4-5 проб, так как перманганат калия является сильным окислителем и может вызвать разрушение рибофлавина.

Затем добавляют пергидроль по каплям до просветления проб, интенсивно встряхивая после прибавления каждой капли (обычно достаточно 2-3 кап.).

Пробирки оставляют стоять 10-15 мин до прекращения выделения пузырьков газа.

Интенсивность флюоресценции измеряют на флюориметре.

Расчет содержания рибофлавина в суточном количестве мочи проводят по формуле:

„ С х (О - К) xV

Х =------- ^— , где

а - Кст

Х - содержание рибофлавина в суточной моче, мкг;

С - концентрация рибофлавина в стандартном растворе, мкг/мл;

О - показание флюориметра для опытной пробы мочи;

К - показание флюориметра для контрольной пробы мочи; а - показание флюориметра для стандартного раствора;

Кст - показание флюориметра для контрольной пробы к стандарту;

V- суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания рибофлавина из мкг/сут в мкмоль/сут - 0,00266.

В норме суточное содержание витамина В2 в моче составляет 0,792,66 мкмоль (300-1000 мкг); часовое натощак - 0,04-0,08 мкмоль (15-30 мкг).

<< | >>
Источник: Савченко А.А.. Витамины как основа иммунометаболической терапии / А.А. Савченко, Е.Н. Анисимова, А.Г. Борисов, А.Е. Кондаков. - Красноярск: Издательство КрасГМУ2011. 2011

Еще по теме Определение рибофлавина (витамина В2) в моче по Е.М. Масленниковой и Л.Г. Г воздовой:

  1. Определение рибофлавина (витамина В2) в крови по Берчугу, Бессею и Лоури
  2. Определение тиамина (витамина Ві) в моче по Вангу и Харрису
  3. Лабораторные методы исследования витаминов. Определение аскорбиновой кислоты в моче по Тильмансу
  4. Витамин В2 (рибофлавин)
  5. Определение N-метилникотинамида в моче по Хуффу и Перлцвейгу
  6. Определение 4-пиридоксиловой кислоты в моче по Хуффу и Перлцвейгу
  7. Определение токоферола (витамина Е) в крови в модификации Фридемана
  8. Определение ретинола (витамина А) и каротиноидов в сыворотке крови по Бессей в модификации Л. А. Анисимовой
  9. Обеспечение витаминами процессов синтеза в клетке. Показания и противопоказания к назначению витамина С
  10. Применение витаминов при регуляции энергетических процессов. Показания и противопоказания к назначению витамина В1
  11. Витамин Р (цитрин, витамин проницаемости)
  12. Витамин В12- дефицитные анемии Метаболизм витамина В12
  13. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  14. Водорастворимые витамины
  15. ВИТАМИНЫ
  16. Жирорастворимые витамины