загрузка...

Определение тиамина (витамина Ві) в моче по Вангу и Харрису

Принцип метода: Определение тиамина основано на его окислении в тиохром красной кровяной солью в щелочной среде с последующим извлечением тиохрома изобутиловым спиртом и измерением флюоресценции.

Реактивы:

1. 20% раствор гидроксида натрия (NaOH).

2. 10% раствор красной кровяной соли [K3Fe(CN)6] квалификации х.ч. или

ч.д.а. Раствор готовят непосредственно перед исследованием.

3. 96% этиловый спирт.

4. Спирт изобутиловый или изоамиловый. Все спирты, используемые в методике, должны быть очищены от флюоресцирующих примесей перегонкой или обработкой активированным углем (температура кипения изобутилового спирта 108°С, изоамилового - 123-130°С).

5. 0,1 М раствор соляной кислоты (НС1).

6. Основной стандартный раствор витамина В1 с содержанием тиамина 100 мкг/мл: 10 мг тиамина вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем до метки. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла, пригоден в течение 4-6 мес.

7. Рабочие стандартные растворы с содержанием тиамина 1-5 мкг/мл: готовят в день проведения исследования из основного стандартного раствора соответствующим разведением 0,1 М раствором соляной кислоты. Например, для получения рабочего раствора с содержанием тиамина 2 мкг/мл в мерную колбу на 100 мл вносят 2 мл основного стандартного раствора (абсолютное содержание тиамина - 200 мкг) и доводят объем до метки 0,1 М раствором соляной кислоты, тщательно перемешивают. Рабочий стандартный раствор пригоден для использования в течение 45 дней. Хранят в холодильнике.

Определение содержания тиамина осуществляют на флюориметре.

Ход определения.

В пробирки с пришлифованными пробками вносят по 5 мл мочи, такой же объем изобутилового или изоамилового спирта и встряхивают интенсивно в течение 2 мин. Моча при этом очищается от посторонних флюоресцирующих примесей.

После расслоения верхний спиртовой слой удаляют отсасыванием с помощью водоструйного насоса.

В две пробирки со стеклянными притертыми пробками вносят по 1 мл очищенной мочи. Одна из них будет служить контролем (К) на наличие в моче не удаленных флюоресцирующих примесей, другая опытом (О) для определения концентрации тиамина в моче.

В пробирку с обозначением “К” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и встряхивают.

В пробирку с обозначением “О” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия, встряхивают и немедленно по каплям при постоянном перемешивании добавляют свежеприготовленный 10% раствор красной кровяной соли до появления желтоватой окраски, не исчезающей в течение 30 с, что обусловлено окислением тиамина в тиохром.

Параллельно с серией опытов готовят серию стандартных проб (Ст), в которые вносят по 1 мл стандартных растворов с содержанием тиамина

1-5 мкг/мл, добавляют по 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и по каплям до появления желтой окраски - 10% раствор красной кровяной соли.

Для того чтобы учесть наличие посторонний флюоресцирующих примесей в реактивах, необходимо поставить контрольную пробу к стандартному раствору (Кст). Для этого берут 1 мл дистиллированной воды, прибавляют 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и 1 -2 капли 10% раствора красной кровяной соли.

Во все пробирки с обозначениями “О”, “К”, “Ст” и “Кст” добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и приливают по 7 мл изобутилового или изоамилового спирта энергично встряхивают в течение 2 мин (одновременно проводят обработку нескольких пробирок). Ставят в темное место для расслоения.

После расслоения отсасывают по 5 мл верхнего спиртового слоя с извлеченным тиохромом в химические пробирки, в которые предварительно наливают по 1 мл этилового спирта для просветления, раствора и смешивают. Отсасывание следует начинать с контрольных пробирок используя предназначенную для этого пипетку.

Интенсивность флюоресценции измеряют на флюориметре.

Флюориметр настраивают по стандартному раствору, наиболее близко совпадающему по показаниям с исследуемой мочой. Как правило, берут стандарт концентрацией 2 мкг/мл и 4 мкг/мл и устанавливают соответственно на 40 и 80 делений.

Измеряют флюоресценцию опытных, стандартных и контрольных

проб.

Расчет содержания тиамина в суточном количестве мочи проводят по формуле:

„ С х (О - К) xV

Х = ^1—, где

а - Кст

Х - содержание тиамина в моче, мкг/сут;

С - концентрация тиамина в стандартном растворе, нмоль/мл (мкг/мл);

О - показание флюориметра для опытной пробы мочи;

К - показание флюориметра для контрольной пробы мочи; а - показание флюориметра для стандартного раствора;

Кст - показание флюориметра для контрольной пробы на реактивы;

V - суточный объем мочи, мл.

Коэффициент для перевода содержания тиамина в моче из мкг/сут в нмоль/сут составляет 2,965.

В норме суточное содержание витамина В1 в моче составляет 4441480 нмоль (150-500 мкг); часовое натощак - 44,5-88,9 нмоль (15-30 мкг).

Содержание свободного тиамина в плазме крови - 30-45 нмоль/л (11,5 мкг/дл).

<< | >>
Источник: Савченко А.А.. Витамины как основа иммунометаболической терапии / А.А. Савченко, Е.Н. Анисимова, А.Г. Борисов, А.Е. Кондаков. - Красноярск: Издательство КрасГМУ2011. 2011

Еще по теме Определение тиамина (витамина Ві) в моче по Вангу и Харрису:

  1. Определение рибофлавина (витамина В2) в моче по Е.М. Масленниковой и Л.Г. Г воздовой
  2. Лабораторные методы исследования витаминов. Определение аскорбиновой кислоты в моче по Тильмансу
  3. Витамин В1 (тиамин)
  4. Определение N-метилникотинамида в моче по Хуффу и Перлцвейгу
  5. Определение 4-пиридоксиловой кислоты в моче по Хуффу и Перлцвейгу
  6. Определение токоферола (витамина Е) в крови в модификации Фридемана
  7. Определение рибофлавина (витамина В2) в крови по Берчугу, Бессею и Лоури
  8. Определение ретинола (витамина А) и каротиноидов в сыворотке крови по Бессей в модификации Л. А. Анисимовой
  9. Тиамина хлорид
  10. Применение витаминов при регуляции энергетических процессов. Показания и противопоказания к назначению витамина В1
  11. THIAMINI HYDROBROMIDUM ТИАМИНА ГИДРОБРОМИД
  12. THIAMINI MONONITRAS ТИАМИНА МОНОНИТРАТ
  13. THIAMINI HYDROCHLORIDUM ТИАМИНА ГИДРОХЛОРИД
  14. Обеспечение витаминами процессов синтеза в клетке. Показания и противопоказания к назначению витамина С
  15. Витамин Р (цитрин, витамин проницаемости)