<<
>>

Флуоресцентная микроскопия

До сих пор мы везде использовали метрическую систему единиц. Введём ещё один новый термин из этой системы — нанометры.

В одном миллиметре 1000 микрон, а в микроне 1000 нанометров. То есть в одном метре миллиард нанометров.

В этом параграфе приведена в нанометрах длина световой волны. Следует упомянуть, что существуют микротомы для приготовления тонких срезов человеческих тканей толщиной от 3 до 5 микрон для лабораторных исследований и толщиной до 5 нм для электронных микроскопов. Для резки последних используются алмазные или стеклянные ножи.

Раньше все флуоресцентные микроскопы работали в проходящем свете с конденсорами, требующими иммерсии при увеличении 20х и более, и с мощными источниками света (до 200 Вт).

Рис. 11. Флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой


В дальнейшем были разработаны специальные красители, дававшие при возбуждении светом флуоресцентное свечение препарата, которое, однако, быстро выгорало под действием возбуждающих лучей. Флуоресцентная микроскопия обычно проводится в тёмных комнатах из-за малой освещенности изображения и его быстрого фотохимического изменения (выгорания).

Для возбуждения флуоресценции применяются узкополосные светофильтры. Так, например, для возбуждения флуоресценции препаратов, окрашенных по ФИТЦ (максимум возбуждения при длине волны 495 нм), применяется светофильтр с полушириной пропускания 10 нм, то есть пропускающий область спектра 485-505 нм. Когда свет проходит через окрашенный препарат, часть препарата, которая адсорбировала краситель, флуоресцирует.


Запирающие светофильтры, установленные в пространстве над объективом, поглощают возбуждающие флуоресценцию лучи, защищая ваши глаза и позволяя вам видеть излучение только той части препарата, которая флуоресцирует.

Так как существует множество красителей, обычно используют поворачиваемый барабан с 4, 5 или 6 возбуждающими светофильтрами, предназначенными для возбуждения светом определённых длин волн. Запирающие светофильтры тоже различаются, хотя постепенно стали использовать только два основных светофильтра. Получение освещения, необходимого для данного метода, стало возможным благодаря применению мощных 200 Вт ртутных ламп. После включения внутри такой лампы создается давление в 14 или 15 атмосфер. Эти дуговые лампы опасны в применении, поэтому при замене их нужно надевать защитные очки.

При применении данного метода возникает множество проблем. Главные из них: многие препараты имеют собственное свечение, которое иногда трудно отличить от флуоресценции, вызванной окраской; кроме того, интенсивность флуоресценции структур препарата быстро падает под действием возбуждающих лучей, что мешает наблюдению и особенно фотографированию препаратов.

С тех пор как этот метод используется в медицине для диагностики заболеваний и определения их тяжести, интерпретация изображения препарата стала крайне важной. Она основывается часто на том, какой цвет флуоресценции клеток виден на чёрном фоне.

Когда фирма «Лейтц» предложила использовать превосходный сухой тёмнопольный конденсор с высоким пропусканием света, но серым фоном, это ни у кого не вызвало серьезного интереса. Пришлось бы обучать всех интерпретации цвета, контрастирующего с серым фоном, а не с чёрным, а это, в свою очередь, вызвало бы множество проблем, хотя позволило бы использовать гораздо больше света, что было так необходимо!

Проводились также эксперименты с применением различных нертутных ламп: ксеноновых, галогеновых, угольных и т. д. с мощностью до 450 Вт. Ценность лампы определялась в зависимости от длин волн и яркости их излучения. Однако для использования таких источников света потребовались бы довольно дорогие трансформаторы большой мощности.

Помните, что с помощью флуоресцентного микроскопа устанавливается первичный медицинский диагноз и что при изменении напряжения в лампе меняется цвет флуоресценции препарата. Чтобы снизить вероятность ошибки, были разработаны новые стабилизаторы напряжения, но микроскопы при этом стали еще более дорогими.

Затем кто-то (скорее всего, это была фирма «Лейтц») сконструировал флуоресцентный осветитель для работы в падающем свете. (Впервые принцип работы флуоресцентного микроскопа в падающем свете с помощью дихроичных светоделителей был предложен в 1948 году советским ученым Е. М. Брумбергом. — Прим. ред.) Этот осветитель состоял из источника света, коллектора и специального опак-иллюминатора, в который вставлялись сменные кубические блоки с возбуждающим и запирающим светофильтрами и интерференционным светоделителем (дихроичным зеркалом). Это позволило увеличить освещённость флуоресцентного изображения и тем самым сделало возможным применение менее мощных ртутных ламп (50 или 100 Вт); кроме того, была обеспечена возможность получения более контрастного изображения.

Благодаря специальным блокам для обычных и специальных красителей работа стала более обыденной и простой. Одни микроскопы имеют место для двух блоков с фиксацией положения каждого; на других устанавливают 4 или даже более блоков. Сегодня обычно используют сочетание флуоресцентной микроскопии с методом фазового контраста. Метод сводится к включению обоих осветителей и к закрытию препарата от эпиосвещения. Проверьте микроскоп, используя методику Кёлера, если понадобится. Сфокусируйтесь на препарат в светлом поле или в фазовом контрасте в проходящем свете, чтобы найти интересующий вас участок препарата. Заблокируйте

проходящий свет, разблокируйте свет, возбуждающий флуоресценцию, и с помощью блока с необходимыми светофильтрами исследуйте препарат и делайте фотографии, если таковые будут нужны.

<< | >>
Источник: Ф. М. Кэррил, С. А. Бабушкин. Как работать со световым микроскопом / Ф. М. Кэррил; (перевод с английского и под редакцией И. Я. Барского, М. М. Аптинова), С. А. Бабушкин. - Москва.: Вест Медика,2010.— 112 с.. 2010
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Флуоресцентная микроскопия:

  1. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
  2. Ф. М. Кэррил, С. А. Бабушкин. Как работать со световым микроскопом / Ф. М. Кэррил; (перевод с английского и под редакцией И. Я. Барского, М. М. Аптинова), С. А. Бабушкин. - Москва.: Вест Медика,2010.— 112 с., 2010
  3. БЛАСТ0ЦИТ03
  4. Возбудитель туберкулеза и его свойства.
  5. СТР0НГИЛ0ИД03
  6. ЗАДАЧИ КОЛЬПОСКОПИИ
  7. Методи генетичного аналізу
  8. Мази
  9. Диагноз и дифференциальный диагноз
  10. План обследования больного при ВДА
  11. ПРИЧИНЫ ИНФЕКЦИОННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
  12. Дифференциальный диагноз
  13. Патогенез