<<
>>

§ 4, Качественное определение

Несмотря на отсутствие строго специфических реакций, применение следующего комплекса проб позволяет сделать заключение о наличии сердечных гликозидов. Качественные реакции проводятся либо с индивидуальными веществами, либо с очищенным извлечением из растительного сырья.

Для этого несколько капель извлечения упаривают досуха на часовом стекле или в выпарительной чашке, а сухой остаток растворяют в нужном растворителе.

Все реакции на сердечные гликозиды можно разделить на 3 группы: 1) реакции на углеводную часть молекулы (2-дезоксиса-

членное лактонное кольцо не найдены достаточно специфические реактивы. Для обнаружения буфадиенолидов на хроматограммах используют 20%-ный раствор треххлористой сурьмы в хлороформе.


Методики качественных реакций. Приготовление извлечения: 5 г измельченных листьев наперстянки заливают 50 мл 80%-ного УТИ л ов о го спирта, настаивают 24 ч. Спирт отгоняют под вакуумом, водный остаток промывают в делительной воронке четыреххлори- стьгм углеродом 6 раз по 10 мл. Сердечные гликозиды извлекают смесью хлороформ — изопропиловый спирт (3:1) 4 раза по 10 мл. К полученному извлечению добавляют 2 г безводного Na,S04, дают постоять 3—5 мин, а затем отфильтровывают через бумажный фильтр.

Качественные реакции. Реакция Келлер — Килиани. Готовят два раствора: 1 — ледяная уксусная кислота, содержащая следы Fea(S04)3; 2 — концентрированная серная кислота также со следами Fe,(S04}3. Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в растворе I и осторожно по стенке пробирки вливают раствор 2. При наличии дезоксисахара верхний слой через некоторое время окрасится в васильково-синий цвет.

Реакция Либермана—Бурхарда. Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в ледяной уксусной кислоте и добавляют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (50:1). Через некоторое время развивается окраска от розовой к зеленой и синей.

Реакция Розенгейма. Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в хлороформе и смешивают с 90%-ным водным раствором трихлоруксусной кислоты. Появляются сменяющие друг друга окраски от розовой до лиловой и интенсивно синей.

Реакция Легаля. Готовят два раствора: 1 — 5%-ный раствор нитропруссида натрия; 2 — 10%-ный раствор едкого натра. Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в 0,5 мл 100%- пого метилового спирта. Полученный раствор вливают в пробирку и добавляют 1—2 капли раствора I. Затем, осторожно (не взбалтывая!) по стенке добавляют 1—2 капли раствора 2. На границе 2 растворов появляется красное окрашивание в виде кольца.

§ 5. Количественное определение

До настоящего времени не представлялось возможным установить содержание того или иного сердечного гликозида в присутствии других, так как реактивы, предложенные для количественного определения гликозидов, являются общими.

Поэтому весьма пер-
елективним считается сочетание хроматографии с дальнейшим использованием фотометрии, потенішометрии, полярографии, флуори- метрии и др.

Хорошие результаты получают при хроматографии на бумаге, пропитанной формамидом. В этом случае применение систем бензол — хлороформ (9:1); (7:5); (3:7) или смесей толуол н-бутанол (9:1); (4:1); (2:1); (1:1), смесей состава этилацетат — бензол — вода’ (84:16:50), хлороформ — бензол —н-бутанол (78:12:5) или просто хлороформа в качестве подвижной фазы позволяет достичь четкого разделения отдельных групп гликозидов. В последние годы также широко используется тонкослойная хроматография. В качестве сорбента могут применяться тальк, силикагель, кизельгур и др. Системы используются такие же, как для бумажной хроматографии.

Для обнаружения гликозидов на хроматограммах применяют реактивы, вызывающие флуоресценцию или окрашивание. Наиболее широко применяют смесь 25%-ной трихлоруксусной кислоты и 3%-ного раствора хлорамина в этиловом спирте (15:1). В УФ свете производные дигитоксигенина дают четкую золотисто-желтую флуоресценцию; гитоксигенина — голубую; дигоксигенина стальную.

Для количественного определения наиболее простыми и доступными считаются фотометрические методы — фотоколориметрия и спектрофотометрия сердечных гликозидов и их генинов в видимой области спектра. Эти методы основаны на цветных реакциях сердечных гликозидов с различными нитросоединениями (пикрат натрия, 3,5-динитробензол и др.) или ксантгидролом. Для приготовления эталонного раствора можно использовать кристаллические гликозиды, но ввиду трудности их получения были рекомендованы также растворы дихромата калия и сульфита натрия.

Флуориметрические методы основаны на способности сердечных гликозидов флуоресцировать под действием сильных кислот (концентрированные серная, фосфорная кислоты) и окислителей (перхлорат железа, хлорное железо) после кратковременного облучения УФ светом. Эти методы применимы только к сердечным глико- зидам, которые в результате дегидрирования образуют моно- и диангидросоединения.

В основе полярографических методов определения сердечных гликозидов лежит их способность восстанавливаться на ртутнокапельном электроде при потенциалах 1,9—2,0 В, образуя диффузные токц, волны которых пропорциональны концентрации сердечных гликозидов.

В последние годы для количественного определения сердечных гликозидов стал применяться метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). При этом вначале сердечные гликозиды превращают в летучие производные путем силилирования, ацетилирования и получения гептафторбутиратов, а затем подвергают анализу.

Нормативно-техническая документация на лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды, наряду с физикохимическими методами количественного определения требует обязательной стандартизации сырья биологическими методами.

По требованиям ГФ X биологическая стандартизация сердечны гликозидов проводится на лягушках, кошках и голубях. Актив- ноетЕї оценивают по сравнению со стандартным кристаллическим препаратом и выражают в единицах действия (лягушачьих, кошачьих и голубиных).


В НТД на лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды, обязательно указывается валор. Валор сырья — по количество единиц действия В 1 г сырья.

Наиболее часто используется стандартизация на лягушках. К основным недочетам этого метода относятся следующие: 1) исследования проводятся на холоднокровных животных, генетически далеко отстоящих от человека; 2) определяется смертельная доза, югда как для клиники важно правильно определить терапевтиче- I кие дозы, 3) лягушки используемых видов распространены не во всех районах нашей страны и не во всех странах; 4) малая точность метода (it 20—25 %) ввиду резко изменяющейся чувствительности лягушек в зависимости от времени года и других условий.

Метод биологической стандартизации на кошках, принятый 1 Ф более точен (± 5—10 %), но также достаточно трудоемок.

Методики количественного определения. Ни один из вышеназванных методов количественного определения сердечных гликозидов не является идеальным, каждый имеет свои недостатки. Количественное определение таких лабильных веществ, как сердечные гликозиды, нуждается в индивидуальном подходе в каждом конкретном случае.

Методика количественного определения ланатозидов А, В, С " листьях наперстянки шерстистой --- Folium Digitalis lanatae. Методика основана на хроматографическом разделении сердечных гликозидов с последующим спектрофотометрическим определением.

5 г измельченного сырья (точная навеска) (сито с диаметром отверстий 1 мм) помещают в склянку темного стекла с притертой пробкой, заливают 50 мл 80%-ного метилового спирта и настаивают в течение 24 ч. Жидкость отфильтровывают на воронке Бюхнера и берут для исследования 40 мл извлечения (что соответствует 4 г сырья). Извлечение упаривают на водяной бане под вакуумом при н'мпературе 50—60 °С до удаления спирта. К .оставшемуся объему г і —4 мл) добавляют 5 7 мл воды и помещают в делительную воронку. Водный раствор очищают четыреххлористым углеродом !,аз по ^ Е1з очищенного водного раствора гликозиды извле-


(4 ч- 1) P-D-Дигитоксоза

І

(4 ч- 1) p-D-ацетилдигитоксоза

І

(4-*- 1) Р-D-глюкоза





кают смесью хлороформа и изопропанола (3:1) 4 раза порциями по 10 мл. Полноту извлечения гликозидов контролируют реакцией ,’іегаля, X л ор офор м н о-и зо пр о и а н ол ь н о е извлечение обезвоживают сульфатом натрия и фильтруют через бумажный фильтр. Сульфат натрия на фильтре промывают 5 мл обезвоженной смеси, которую присоединяют к фильтрату и отгоняют досуха под вакуумом на водяной бане при 50 °С. Сухой остаток количественно переносят и откалиброванный пикнометр вместимостью 3 мл с помощью смеси хлороформ ■—метиловый спирт (1:1). Полученный раствор подвергают хроматографированию.

Хроматография проводится в тонком слое сорбента (тальк). Па подготовленной хроматографической пластинке размером 13 X х 18 см намечают стартовую линию на расстоянии 1,5 см от нижнего края. На стартовую линию пипеткой с оттянутым в капилляр носиком наносят два пятна раствора гликозидов по 0,01 мл и пятно (0,01 мл) — раствор абицина («свидетель»). Пластинку помещают в камеру и хроматографируют восходящим способом 30—35 мин. Длина пробега подвижной фазы 12 см. В качестве подвижной фазы используется система: хлороформ — этиловый спирт — бензол —

({юрмамид (59 : 10 : ЗО : 1).

; — часть хроматографической плястимкн* обработанная реактивом; И — необработанная реактивом; / — спиртовой раствор «абицина»; А— ланатОэид А; В — ланатозид В; С — ляігато- зид С; 2 и а — очищенное извлечение из листьев наперстянки

Пластинку высушивают на воздухе 5 мин, затем '10 мин в сушильном шкафу при J? = 120 °С. Одну половину пластинки (пятно «свидетеля» и I пятно извлечения) обрабатывают 25%-ным раствором трихлоруксуспой кислоты в лиловом спирте с добавлением 0,2 % хлорамина Т. После обработки пластинку высушивают 10 мин в сушильном шкафу при t = 120 °С (рис. 6). Ланато- 1пды проявляются в виде пятен серо- сппего цвета. Точные границы устанавливают в ультрафиолетовом свете. Ланатозид А обладает ярко-желтой флуоресценцией; В — зеленовато-голубой; С — голубой.

На второй половине пластинки (необработанной) пятна лана- імзидов отмечают по проявленной полосе и стандарту. Rf пятен ланатозидов в этой системе: А —0,74; В —0,43; С — 0,24.

После установления границ пятна лапатозидов А, В, С снимают с пластидки, количественно переносят на стеклянный фильтр Alb 4 и элюируют 20 мл смеси хлороформ — метиловый спирт (I : 1). Элюат упаривают досуха па водяной бане под вакуумом при t = 50—60 °С. К сухому остатку добавляют 5 мл ксантгидро- ,.пятого реактива, нагревают 5 мин на кипящей водяной бане, охлаждают 5 мин в холодной воде и выдерживают 15—20 мин при ком-
патной температуре. Появляется окрашивание от розовых до малиновых тонов. Окрашенный раствор помещают в кювету толщиной 1 см и определяют оптическую плотность при 528—532 нм на спектрофотометре СФ-4А на фоне контроля [1]. Контролем служит элюат с чистого сорбента. Калибровочный график строят по ланатозиду С (целаниду), процентное содержание ланатозида в абсолютно сухом сырье рассчитывается но формуле

1,05а V7! 10 Х~ IVilOOOOO ’

где а — количество вещества, найденное по калибровочному графику; V\ — объем экстракта, мл (пикнометр); — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мл; т — масса навески абсолютно сухого сырья, г; 1,05 — поправочный коэффициент.

Подготовка хроматографических пластинок. 4 г. талька помещают в колбу на 25 мл, приливают 7 мл 95%-ного этилового спирта я

1 мл смеси фор мам ид — ацетон (3:7). Смесь взбалтывают 30—40 с и выливают на пластинку, равномерно распределяя по всей площади. Пластинку высушивают на воздухе 20—25 мин и 10 мин в сушильном шкафу при t = 50 — 60 “С. Для хроматографии необходимы только свежеприготовленные пластинки.

Подготовка камеры для хроматографирования. В качестве подвижной фазы используют систему 95%-ный этиловый спирт — бензол — хлороформ — формамид (10:30:59:1). Систему помещают в делительную воронку и взбалтывают 10 мин, затем отстаивают 10 мин. Заливают в камеру так, чтобы верхний слой фор мам и да не попал в камеру. Насыщение камеры идет 20— 25 мин. Для лучшего насыщения камеры стенки выкладываются фильтровальной бумагой. Снаружи камера должна быть закрыта черной бумагой. Систему необходимо менять при последующем хроматографировании,

1. Приготовление ксантгидролового реактива. 10мг ксантгидрола растворяют в 99 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 1 мл концентрированной НС1.

2. 25% -ный раствор грихлоруксусной кислоты с добавлением 0,2 % хлорамина Т — готовится непосредственно перед проявлением.

3. Проведение реакции Л стал я. Готовятся кex tempore»

2 раствора: 1—5%-ный раствор питропруссида натрия (готовится в мерной колбе) и 2 — 10% -ньтй раствор едко го натра (водный). В выпарительной чашке 3—4 капли извлечения упаривают досуха, растворяют в 0,5 мл 100%-ного метилового спирта. Растворенный сухой остаток вливают в пробирку и добавляют 1—2 капли реактива 1, затем осторожно по стенке добавляют 1—2 капли реактива 2 и, не взбалтывая, смотрят. Если есть сердечные гликозиды, то из границе 2 растворов появляется красное окрашивание в виде кольца.

4. Построение калибровочного графика. Калибровоч- кий график строится по стандартному раствору ланатозида С (целанида). 25 мг це.дапида растворяют в 25 мл смеси метиловый спирт — хлороформ (1:1) в мерной колбе. Наносят на хроматографическую пластинку в количестве от 0,01 до 0,08 мл раствора, а далее поступают как с испытуемым извлечением.

Реактивы и оборудование: метиловый спирт (метанол); четыреххлористый углерод; изопропиловый спирт (изопропанол); хлороформ; ацетон; формамид; Na2S04 (безводп.); тальк; этиловый спирт (этанол); ксантгидрол; три- хлоруксусная кислота; хлорамин Т; НС! (конц.); уксусная кислота (лед.); бензол; NaOH 10%-вый; нитропруссид натрия 5% -ный; абицина раствор в смеси метиловый спирт — хлороформ (1:1).

I»БВместимостью 100 мл; воронки воронка делительная вместимостью 200 Л- І,ІЬ,М. ШЛ|1Ф0М вместимостью 50 мл; плоскодонные вместимостью 25 100 и 250 мл- колбы wen’w'6 на 50 и 10 мд: к°лбы ■В.ройки стеклянные для Фитьтвовяния ' „ І! [2] ЖрИЫе пмсствмасть!о 25 мл; ■ч мл; микропипетка измерительная вместимостью 0 в1ИкномеТр вместимостью для ТСХ размером 13 X 18 см- ппо^скГстЛ’п^°' ' ПЛастинКіІ ^еклюшые лабораторный с нормальным шлифом; бюретка с npHrepT^K^fШ СТеклянкЬ1Й in мл; камера хроматографическая для ГГ у. краном вместимостью

пая; фильтры бумажные; 8™™ л^Р1^вдГьвериэатар: игла препай°валь-


Штодика количественного определения, главных сердечных гои ктидт в листьях ландыша (Folium Convallariae). Методика осію і ана на хроматографическом разделении и последующейспекЇЇо' «іюіометрическом определении сердечных гликозидов р

D-рамноза;—

н О сн3 'М '

/\

D - г у л омети л оза—

ценных (сито с.диаметром отверстий 3 мм) сухих листьев ландыша

и кипятят 30 мин. „ 0/

Раствор охлаждают и доводят до первоначальной массы /и /о-иым

этиловым спиртом. г

Полученный экстракт фильтруют, отбирают 27,о г (что соответствует 2,5 г сырья) и отгоняют спирт под вакуумом при I —

= 55—60 °С. К теплому экстракту добавляют 3 мл раствора основного ацетата свинца, перемешивают 10 мин, затем центрифугируют 5 мин при скорости 5000 об/мин. Промывают осадок 2 раза, прибавляя по 10 мл воды с последующим центрифугированием. Из очищенного водного экстракта сердечные гликозиды извлекают смесью хлороформ — метиловый спирт (4 : 1).

Экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия, промывают фильтр. Из экстракта отгоняют растворитель в вакууме на водяной бане до объема 3—4 мл. Затем раствор гликозидов упаривают до 1 мл, остаток высушивают. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси хлороформ метиловый спирт (1 : !)■ Хроматографируют на бумаге восходящим способом в системе этилацетат — вода (2:1) в течение 20—24 ч. Происходит разделение кон- валлятоксина и дезглюкохейротоксина. Если хроматографировать нисходящим способом, то происходит разделение кон- валлозида, локундьезида и конвалляток- сола (рис. 7). Проявитель — насыщенный раствор трех хлористой сурьмы'в метиловом спирте. Пятна гликозидов окрашиваются в розово-фиолетовый цвет.

Элюируют метиловым спиртом. Растворитель отгоняют под вакуумом. Остаток растворяют в метиловом спирте, прибавляют пикрат натрия, отфильтровывают и измеряют оптическую плотность. Контролем является смесь тех же количеств метилового спирта и пи- крата натрия. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 494 нм в кювете толщиной 1 см.

С помощью градуировочного графика стандартного конвалля- токсина определяют содержание гликозидов в 1 мл элюата.

Реактивы и оборудование: этиловый спирт 95%-цкй (этанол); свинка ацетат (основной) раствор; хлороформ; Na2S04 (безводн.); метиловый спирт (метанол); этилацетат; сурьма треххлористая; натрий ни крат; вода дистиллированная.

Колба с нормальным шлифом, круглодонняя, вместимостью 2об мл, холодильник обратный стеклянный лабораторный с нормальным шлифом; цилиндры мерные на 10 мл; пробирки для центрифугирования; воронки делительные вместимостью 100 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; микропипетка измерительная вместимостью 1 мл; бумага хроматографическая; хроматографическая для ИХ; весы ручные; спектрофотометры СФ-4А, С.Ф-1 , бани водяные лабораторные; пульверизатор; центрифуга лабораторная.

<< | >>
Источник: Коллектив авторов. Химический анализ лекарственных растений: Учеб, пособие для фармацевтических вузов /Ладыгина Е. Я., Сафро- нич Л. Н., Отряшенкова В, Э. и др. Под ред. Гринкевич Н. И., Сафронич Л. Н.■— М.: Высш. школа, 1983,— 176 с., ил.. 1983
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме § 4, Качественное определение:

  1. Глава 5 Анализ качественных признаков
  2. Анализ качественных признаков
  3. Год жизни, прожитый качественно (QALY)
  4. КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРИЗНАКИ: КРИТЕРИЙ МАК-НИМАРА
  5. Количественные и качественные дефекты фагоцитов
  6. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  8. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
  9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH
  11. Г. Определение точки кипения