<<
>>

§ 5, Количественное определение

Для количественного определения сапонинов в растительном сырье применяют методы, основанные на использовании биологических и физических свойств сапонинов, т. е. определении гемолитического, рыбьего индексов и пенного числа, а также химические методы.

Количественное определение сапонинов гемолитическим мето- дом основано на предположении, что гемолитическое действие прямо пропорционально количеству веществе в растворе.

Из настоя растительного сырья на изотоническом растворе готовят ряд разведений различной концентрации, затем к каждому разведению добавляют по 1 мл взвеси эритроцитов (2%-ной свежей дефибр и кпрова иной бараньей крови в изотоническом растворе) и встряхивают.

Через некоторое время наблюдают результаты гемолиза.

Ввиду того, что различные сапонины при одинаковой концентрации имеют разный гемолитический индекс (механизм гемолиза также различен), каждое сырье должно иметь свой стандарт — раствор чистого сапонина.

Предложен видоизмененный метод определения гемолитического индекса, который заключается в измерении диаметра гемолитического пятна, образующегося при соприкосновении кружка фильтровальной бумаги, смоченного раствором сапонина, с желатиновой суспензией эритроцитов. Однако положительный результат гемолитической пробы еще не является доказательством наличия сапонинов, так как другие растительные вещества (некоторые эфирные масла, кислоты, спирты) также дают гемолиз. Надежность пробы повышается, если гемолиз блокируется добавлением холестерина и восстанавливается после разрушения образовавшегося
комплекса. Некоторые сапонины (хедерин, примуловые кислоты и др ) не образуют холестеридов. Сапонины могут также находиться в растении в виде комплекса со стеролами и не проявлять гемолитической активности до разрушения этого комплекса

Методы определения сапонинов, основанные на повышенной токсичности этих соединений для холоднокровных животных {рыб, головастиков, жаб, червей), не имеют преимущества по сравнению с гемолитическим индексом и сохраняют его главный недостаток — невысокую надежность, невозможность строгого отнесения исследуемых веществ к классу сапонинов.

Методы количественного определения сапонинов, основанные на биологических и физических свойствах последних, так же как опведеление поверхностной активности, гемолитического действия и токсичности сапонинов, дают результаты, которые нельзя взаимно сравнивать, так как эти свойства друг от друга не зависят. Установив одно из них, нельзя говорить о степени проявления второго или третьего. Ни один из перечисленных методов не основан на определении абсолютного содержания сапонинов в сырье.

Что касается химических методов определения сапонинов в растительном сырье, то общих методов не существует. Описанные для некоторых сапонинов химические методы большей частью недостоверны для других. Применяются гравиметрические, титрометрические и фотометрические методы. Особенно широко для количественного определения сапонинов используются колориметрические н спектрофотометрические методы анализа. При разработке новых методов количественного определения сапонинов Прежде всего учитывается химическая структура того или другого сапо-


ШиМетодика количественного определения глицирризиновой кислоты в корне солодки (Radix Glycyrrhizae) (ГФ X, ст.
, ст. 260):

Метод основан на осаждении глицирризиновой кислоты из ацетонового извлечения 25%-ным раствором аммиака с последующим спектрофотометричес КИМ определен нем.

Около 2 г измельченного сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (точная навеска), помещают в колбу с нормальным шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 20 мл' 3%-ного ацетонового раствора HNOa и настаивают в течение 1 ч при частой и сильном взбалтывании. Извлечение отфильтровывают в цилиндр вместимостью 100 мл. Порошок корня в колбе промывают 10 мл ацетона и фильтруют через этот же фильтр. В колбу с сырьем приливают еще 20 мл ацетона, которым одновременно смывают порошок с фильтра, и смесь кипятят с обратным холодильником на водяной бане в течение 5 мин. Извлечение отфильтровывают через тот же фильтр в тот же цилиндр. Экстракцию горячим ацетоном повторяют таким образом еще 2 раза. Порошок корня промывают ацетоном до тех пор, пока объем жидкости в цилиндре не достигнет 100 мл. Жидкость из цилиндра выливают в стакан вместимостью 200 мл. Цилиндр ополаскивают 40 мл этилового спирта, который затем выливают в тот же стакан. Далее по каплям при интенсивном помешивании добавляют концентрированный раствор аммиака до появления обильного светло-желтого творожистого осадка (pH 8,3—8,6 устанавливают по порозовению влажной фенолфталеиновой .бумаги).

Осадок вместе с маточной жидкостью переносят на фильтр, помещенный в воронку Бюхнера, жидкость отсасывают. Стакан и фильтр с осадком промывают 50 мл ацетона в 3—4 приема. Осадок с фильтром переносят в стакан, в котором проводилось осаждение, и растворяют в 50 мл воды, Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл. Фильтр несколько раз промывают небольшими порциями воды, присоединяя их к основному раствору. Доводят объем раствора водой до метки (раствор А). 30 мл полученного раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки (раствор Б).

Определяют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 258 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, применяя в качестве контрольного раствора воду.

Процентное содержание глицирризиновой кислоты х вычисляют по формуле

D822 ■ 250.500 • 100 * mV 1000 ■ 11 000 ’

где D — оптическая плотность раствора Б; т — масса навески сырья, г; V — объем раствора А, использованного для приготовления раствора Б, мл; 822 — молекулярная масса глицирризиновой кислоты; 11 000 — молярный показатель поглощения.

Содержание глицирризиновой кислоты в сырье должно быть пе менее 6 %.

Реактивы и оборудование: HNOa 3% -яый ацетоновый раствор; ацетон; этиловый спирт 95%-ный (этанол); аммиак 25%-ный раствор; вода дистиллированная.

Бумага фенолфталеиновая; колбы плоскодонные с нормальным шлифом вместимостью 150 мл; цилиндры мерные на 50 и 100 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; холодильник (обратный) стеклянный лабораторный с нормальным шлифом; стаканы стеклянные вместимостью 250 мл; воронки Бюхнера; колбы Бунзена; колбы мерные вместимостью 250 и 500 мл.

Методика количественного определения сапонинов в корневище с корнями диоскореи ниппонской (Rhizoma сит radicibus D ioscoreae пірропісае) (ФС 42-1521-80)* От аналитической пробы сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отЕєрсгий 10 мм, отбирают окало 20 г и измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют пипеткой 50 мл 95%-ного этилового спирта и вносят остеклованный переме- шпваюший стержень. Колбу с содержимым взвешивают (с погрешностью до 0,1 г) и нагревают на магнитной мешалке в течение 1 ч с момента закипания растворителя. По окончании указанного времени экстракт охлаждают до комнатной температуры, потерю в массе восполняют 95%-ным этиловым спиртом, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр 30—40 мл раствора, 5 мл фильтрата переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем раствора доводят до метки 95%-ным этиловым спиртом и тщательно перемешивают (раствор А).

5 мл раствора А пипеткой переносят в стеклянную пробирку с нормальным шлифом и сюда же прибавляют пипеткой 5 мл 1 %-иого л-диметиламинобензальдегида в 4 и. спиртовом растворе соляной кислоты. Пробирку закрывают стеклянной пробкой, резиновым колпачком, встряхивают для перемешивания жидкости и нагревают в течение 2 ч в ультратермостате при температуре 58 zp 0,5 °С. Раствор охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры и определяют его оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 518 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют смесь 5 мл раствора А и 5 мл 4 н. спиртового раствора соляной кислоты, который также выдерживают в ультратермостате при 58 ± 0,5 °С.

Процентное содержание фурастаноловых гликозидов х в пересчете на абсолютно сухую массу вычисляют по формуле а0,0101 -50-10-.100 ■ 100 а50-500

m (100 — ю) К “ 1И(100 — w)K '

где а — количество хлорида кобальта, найденного по калибровочному графику, г; 0,0101 — коэффициент пересчета концентрации хлорида кобальта на концентрацию фурастаноловых гликозидов; 50 — исходный объем извлечения, мл; 10 — число разведений; т — масса навески сырья, г; се/ — потеря в массе сырья при высушивании, %; К — поправочный коэффициент на титр кислоты.

Построение калибровочного графика: 5 г хлорида кобальта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют дистиллированную воду, 1 каплю концентрированной НС1 и доводят объем До метки водой. В мерные колбы вместимостью 25 мл отмеряют бюреткой 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15 мл исходного раствора и объем доводят до метки. Полученные растворы

содержат соответственно 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03 г хлорида кобальта в 1 Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при для ВОЛНЫ ole HMJJ кювете с толщиной слоя 1 см, и по полученным данным СТРОЯТ калибровочный график. Для построения графика необходимо по 3 измерения в каждой точке. По оси ординат откладывают значение оптической плотности а по оси абсцисс содержание хлорида кобальта в 1 мл в граммах.

Реактивы и оборудование: этиловый спирт 95%-цый (этанол)- я - Ди м ет и л а м и н бе і тза д ь дег и д 1%-пый раствор в 4 н. спиртовом растворе НС1' кобальт хлорид; НС1 (конц.); НС1 1%-ный раствор в ЭТИЛОВОМ спирте.

Колбы мерные вместимостью 50 и 103 мл; колбы конические вместимостью 100 мл; Колбы плоскодонные вместимостью 1 ООмд; магнитные мешалки; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; пипетки измерительные вместимостью о мл; пробирки стеклянные с нормальным шлифом; ультратермостат- спектрофотометр; с и та с диаметром отверстий 2 и 10 мм; весы ручные- ступка металлическая с пестиком; .челы-шца; шкаф сушильный лабораторный; бюретки вместимостью 25 мл; бкжсы с притертыми крышками; эксикатор.

Методика количественного определения аралозидов в корнях аралии миньчжурекой (Radix Araliae mandshuricae)'.





10,0 г (с погрешностью до 0,01) измельченных корней аралии маньчжурской, проходящих сквозь сито № 1, помещают в шлифо- вую колбу вместимостью 500 мл, приливают 50 мл хлороформа и'нагревают с обратным холодильником на водяной бане в течение 1,5 ч (температура бани 60 °С). Хлороформное извлечение фильтруют через вату и фильтрат отбрасывают* Вату с осадком помещают в колбу с сырьем, снова приливают 50 мл хлороформа, нагревают в течение 1,5 ч. Хлороформное извлечение фильтруют через воронку Бюхнера с бумажным фильтром. Сырье вместе с фильтром переносят в фарфоровую чашку и оставляют стоять на сутки. Затем сырье переносят обратно в колбу, приливают 100 мл метилового спирта. Колбу с содержимым взвешивают, нагревают на водяной бане с обратным холодильником и поддерживают кипение жид- ' кости в течение 5 ч (кипятят с капиллярами, температура бани 80 СС), по охлаждении колбу с содержимым снова взвешивают, потерю в массе пополняют метиловым спиртом, затем перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. 50 мл фильтрата (5 г исходного сырья) помещают в колбу вместимостью 100 мл и метиловый спирт отгоняют на водяной бане с вакуумом. Остаток растворителя в колбе удаляют продуванием воздуха, Сухой остаток растворяют в 20 мл смеси: СНяСООН (лед.) — НС1 (кони.) — НаО (3,5 : 1 : 5,5) и кипятят в колбе с нормальным шлифом вместимостью 100 мл с обратным холодильником на солевой бане (69 г хлорида кальция на 100 мл воды) при температуре не выше 120 °С в течение 2 ч. По окончании гидролиза из выпавшего осадка проводят извлечение продуктов гидролиза, дважды добавляя по 20 мл бензола через холодильник при взбалтывании и нагревании жидкости до кипения, затем горячий раствор переносят в делительную воронку, После расслоения жидкости бензольное извлечение сливают в колбу

вместимостью 250 мл, а водный слой — обратно в колбу для гид лиза и повторяют исчерпывающее извлечение бензолом 3 ра порциями по 20 мл, каждый раз нагревая жидкость до кипения. К объединенному бензольному извлечению прибавляют 80 мл воды, и жидкость нагревают до кипения, затем ее переносят в делительную воронку и после полного расслоения жидкости отбрасывают водный слой. Бензольное извлечение отмывают от кислоты таким образом 3—4 раза до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге, затем фильтруют в круглодогшую колбу для отгонки вместимостью 250 мл через бумажный фильтр, на который предварительно помещают 5 г свежепрокаленпого Na.,S04, промытого 10 мл бензола. Воронку и фильтр промывают 20 мл горячего бензола 3 раза. Бензол отгоняют под вакуумом на водяной бане досуха. Сухой остаток растворяют в смеси растворителей; метиловый спирт — хлороформ {1:9}, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и объем раствора доводят этой же смесью растворителей до метки. 10 мл полученного раствора переносят в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 100 мл'той же смеси растворителей и 5 г силикагеля марки К.СК. Смесь перемешивают встряхиванием, затем количественно переносят на стеклянный фильтр № 4 и продукты гидролиза полностью извлекают смесью растворителей: метиловый спирт — хлороформ (I : 9) 10 раз порциями по 20 мл,, после чего проводят пробу на полноту извлечения. Для этого сухой остаток от нескольких капель фильтрата растворяют в 0,2 мл уксусного ангидрида и прибавляют 1—2 капли концентрированной HjSCV Если появляется малиновое окрашивание, то силикагель промывают еще.

Объединенный фильтрат отгоняют досуха на водяной бане под вакуумом. Сухой остаток растворяют в 30 мл пропилового спирта при нагревании (температура бани около 50 чС), количественно переносят в стакан для титрования и титруют 0,1 н. NaOH в смеси бензола и метилового спирта потенциометрнчески. В качестве индикаторного электрода применяют стеклянный электрод, электрода сравнения — насыщенный (в метиловом спирте) каломельный электрод. Параллельно проводят контрольный опыт. 1 мл 0,1 н. NaOH соответствует 0,10422 г аммонийных солен аралозидов А, В, С (считая на аммонийную'соль аралозидов усредненной молекулярной массы). Процентное содержание аммонийных солей аралозидов А, В, С х вычисляют по формуле:

0, 10422 (V — Цт) 50 0 00 т (100 — да) ’

где V — объем 0,1 н. NaOH, израсходованного на титрование пробы, мл; К, —объем 0,1 н. NaOH, израсходованного на титрование контроль ной пробы, мл; т — масса навески сырья, г; w — потеря в массе сырья при высушивании, %. Содержание аммонийных солей аралозидов А, В, С в пересчете на абсолютно сухое сырье должно быть не менее 4,5 %.

Реактивы и оборудование: силикагель марки КСК: хлороформ; метиловый спирт (метанол); HaS04 (копи.); HnSOj 20%-ная; H2S04 2 н.; CaS04 (гипс); сапа рал і спиртовой р-р; уксусная кислота (лед.); НСІ (кона.); СзСР; бензол; Na,S04 (безводн.); уксусный ангидрид; пропиловый спирт.

Бумага индикаторная универсальная; колбы шлифовые круглодонные с нормальным шлифом вместимостью 100 и 250 мл; колбы плоскодонные с нормальным шлифом вместимостью 200 и 500 мл; цилиндры мерные на 50 мл; холодильник (обратный) стеклянный лабораторный с нормальным шлифом; воронки делительные вместимостью 250 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; колбы плоскодонные вместимостью 100 и 250 мл; колбы мерные вместимостью 25 мл; воронки Бюхнера; колбы Бунзена; чашки фарфоровые; бюксы с притертыми крышками; стекло часовое; фильтр стеклянный Ай 4; стаканы стеклянные вместимостью 100 и 300 мл; микропипетка измерительная вместимостью 0,2 мл; пластинки стеклянные для ТСХ размером 13 X 18 [см]; камера хроматографическая для ТСХ; пульверизатор стеклянный герметически закрытый; бани солевые; шкаф сушильный лабораторный; электрокофемолка бытовая.

<< | >>
Источник: Коллектив авторов. Химический анализ лекарственных растений: Учеб, пособие для фармацевтических вузов /Ладыгина Е. Я., Сафро- нич Л. Н., Отряшенкова В, Э. и др. Под ред. Гринкевич Н. И., Сафронич Л. Н.■— М.: Высш. школа, 1983,— 176 с., ил.. 1983

Еще по теме § 5, Количественное определение:

  1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
  3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ВСАСЫВАНИЯ ЛЕКАРСТВ
  4. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПРОЧНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ
  5. 9.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ЭЛИМИНАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
  6. Количественные и качественные дефекты фагоцитов
  7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТОКСИЛЬНЫХ ГРУПП
  9. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
  10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ pH
  11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
  12. Г. Определение точки кипения