<<
>>

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА КУ МАРИНОВ, ФЛАВОНОИДОВ, АНТРАХИНОНОВ И КАРДИОСТЕРОИДОВ и ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ АИТРАХИНОИА, КУМАРИНА И ФЛАВОНОИДОВ

Хроматография на бумаге

Химию природных соединений, как и вообще химию сегодняшнего дня, невозможно представить без хроматографических методов анализа. Основоположником отого метода является русский ботаник и биохимик М.

С. Цвет [290]. В анализе веществ растительного происхождения наибольшее распространение получили методы хроматографии па бумаге, в тонких слоях сорбента и газожидкостная хроматография.-

Из перечисленных хроматографических, методов первым получил официальное признание в фармацевтическом анализе метод хроматографии на бумаге.

Производные антрахинона являются классическими соединениями, на которых шла проработка теоретических вопросов хроматографии и в частности хроматографии на бумаге.

Как справедливо отмочено в обзорных статьях А. С. Романовой с соавторами [232—234]. применение хроматографических систем с целью качественной и количественной характеристики производных антрахинона обусловлено различной растворимостью агликонов и их гликозидов в безводных органических растворителях. Вторые — мало растворимы в них, но хорошо растворимы в воде и смесях воды со спиртами, поэтому для хроматографии на бумаге применяются системы растворителей двух групп: смеси спиртов с водой (иногда с добавлением кислот — для разделения антрагликозидов) и малополярпые растворители — бензол, толуол, потролейный эфир и их смеси со спиртами для разделения агликонов.

Содержание большого количества полярных групп в виде СО, ОН, СООН и сахарных остатков приводит к значительной сорбции антрахинонов бумагой, в связи с чем последнюю

Хроматографические данные производных антрахинони [96, 474]
Соединение hli и системах* і
1 2 3 \ 5 6 7 8 9 to
9, 10-Антрахинон 25 73 45 90 90
1 -Оксиантрахинон 4 5 42 84 89 72 89
2-Оксипнтрахинон 70 76 27 6 19
1,2-Диоксиаитрахинон (ализарнп) 58 2 71 85 32 7 4 17 98
1,4-Диоксиантрахинон (хинизарин) 18 80 34 73 90 67 89 88
1,5-Диоксиантрахинон 15 26 67 87
1, 6-Диоксиантрахннон 85 9 29
1,8-Диоксиантрахинон 20 37 —- 61 82 —■
1,8-Диокси-З-ыетилантрахинон (хризофановая кислота) _ _ _ _ 85 _ 92 _ 90 97
1,З-Дшжси-З-метнлантрахипон (ру- биадпн) _ „ _ _ _ _ 49 _ „ _
1, 2-Диоксиантрахинон-З-карбоно- вая кислота (муньистин) 90 _
1,3-Диокси-2-метоксиантрахинон (луцидин) 90 -------- ,
1,З-Диокси-З-метилепэтоксиантра- хинон (иберицин) 90 _
1,2, З-Триоксиантрахинон 20 0
1, 2, 4-Триоксиантрахшюн (пурпурин) _ _ _ 80 27 _ 3 _ _ 90
1,6, 8-Трпокси-З-метилантрахинон (франгулаэмодин) _ _ 51 _ ___ 52 _ 81 90 _ _ _
1,8-Диокси-3-оксішетилантрахи- нон (алоээмодин) 15 85
1, 8-Диоксиантрахинон-З-карбоно- вая кислота (реин) 0 - 57

* Системы растворителей при хроматографировании антрахинонов на бумаге: 1—!)0%-я уксусная кислота — 1-бромяафталин; 2 — н-гександимггил- формамид; 3 — бензин, насыщенный 80 %-м спиртом; 4 — бензин — метиловый спирт — уксусная кислота — вода (30 : 60 : 4,5); 5—6%-й хлороформ в петро-

лейном вфире; 6 — циклогексан — пиридин (25 : 1) — диметилформамид; Ї — бензин, насыщенный метиловым спиртом; 8 — циклогексан — пиридин (25 : 1) — вода; 9 — етилацетат — муравьиная кислота — вода (10 : 2 : 3); 10 — и-бута- нол — ледяная уксусная кислота — вода (4:1; 5); 11 — иропиловый спирг — етилацетат — вода (4:3:3); 12 — этиловый спирт.


пропитывают формамидом, диметилформамидом и другими растворителями, позволяющими получить четкое разделение и устранить «хроматографические хвосты». С этой же целью в качестве сорбента используют медленно фильтрующую бумагу. Детектирование антрахинонов, как правило, не вызывает затруднений, так как вещества довольно интенсивно окрашены и хорошо видны при дневном свете. Для повышения чувствительности детектирования хроматограммы обра-

Хроматографические данные антрагликозидов [129, 130,

200, 469]

hfiу и системах *■
Соединение 9 10 и 12
1,8-Диокси-3-метилантрахинон-6-а-Ь- рамнопиранозил-4-Р-Ь-глюкопира- нозид (глюкофрангулин) 0 54
1,8-Диокси-3-метилантрахинон-6-а-Ь- рамнониранояид (франгулин) 43 84 _ - ,
І-Оксиаіпрахннон-2-О-примверозид (руберигриновая кислота) 61 _
1-Окси-2-метилантрахинон-3-0-приы- верозид (галиозин) 61 _ _ - ,
2-Окси-3-карбоксиантрахинон-1-0- иримверозид (галиозин) 14 _ _
2-Окси-3-карбоксиантрахинон-1-0- гл юкозид (і ісевдопу риоринглюко-

8ИД)

4 —г»
І-Оксн-2-оксиметилатпрахинон-З-О- нримверозид (луцидин-З-О-прши- верозид) 38
І-Окси-2-окснметилантрахинон-З-О- глюкозид (луцидин-З-О-глюкозид) 72 . 43
І-Окси-З-карбоксиантрахинон-8-О- глюкозид (реинглюкозид) 30 _ __
Сепозид:

А

_ , 26 32
В 15 15
С 52 43
D 31

* Ем, табл, 2,


батывают различными реактивами, повышающими интенсивность окраски: спиртовым раствором ацетата магния, парами аммиака, водными растворами гидроксида натрия или калия, карбоната натрия [418]. Для антронов применяют 0,1 %-й раствор в-нитрозодиметпланилина [234],

Система пиридин — вода — бензол (1 : 3 : 1) в сочетании с реактивом проявления 1 %-го раствора в-нитрозодиметил- анилина в пиридине позволяет открывать незамещенные у С3 и С10 антроны, в особенности 1, 8-дпоксиантроны. Содержащиеся в растениях наряду с 1, 8-диоксиантрахинонами флавоноиды, ксантоны, кумарпны, сахара, аминоспирты не мешают определению [234].

Наиболее распространенные системы для антрахинонов и антрагликозидов представлены в табл, 2 и 3. Анализ таблиц показывает отсутствие единой системы для разделения агли-

Хроматографические данные простейших кумарнпов [92, 1СС, 227] bgcolor=white>—
Соединение hltf в системах *
1 2 3 4 5
Кумарин (5,6-бензо-а-ппрон) 14 85 88 - ,
3-Метил кумарин 49 —■
4-Метилкумарин 16
З-Фенилкумарин 48
4, 7-Диметилкумарпн 28 —■
7-Оксикумарин (умбеллпферон) 3 65 83 45
7-Метоксикумарин (герниарин) 7 85 87 55
8-Метокспкумарин 4 -- і
7-Метокси-8-изопентилкумарин (остол) 7-Метокси-8-(2, 3-эпоксиизопентил)-ку- 86 91 86 89 “•
марин (меранцин)

7-Окси-6-изопснтенилкумарин (остру-

30 75

і

тин) 92 93
6-Метокси-7-оксикумарин (скополетин) 40 70 55
6, 7-Диоксикумарин (оскулетпн) 13 28
7, 8-Диоксикумарин (дафнетип) И 40
5, 7-Диметоксикумарин (лиметин) 7-Окси-С-О-Р-глюкозилкумарпн (эску- 86 88
лин) 4 И —•
7-0-(3-глюкозилкумарин (скиммнн) 7-Фарнезилоксикумарин (умбеллипре- 19 31
НИН) 80
7-Ацетоксикумарин 55
7-Изопентеноилоксикумарин ‘—■ 51

* Условия хроматографирования (марка хроматографической бумаги, система растворителей, способ детектирования): 1 — бумага ватман ■№ 1, пропитанная 20%-м водным раствором этиленгликоля или пропиленглиноля, Подвижная фаза — бензин. Температура 10 °С, Способ хроматографирования — нисходящий. Детектирование в УФ-свете и реакции диазотирования; 2 — бумага «для хроматографии» марки Б, пропитанная 20%-м водным раствором этиленгликоля. Подвижная фаза — петролейний эфир, Температура 20 °С. Бремя 1,5—2 ч. Способ хроматографирования — ниоходящий. Детектирование в УФ-свете и диазоти- > роваьным гї-нитроанилином; 3 — бумага ватман Л1» 1, пропитанная 0,1 М раствором натрия бората, Подвижная фаза — «-бутанол, насыщенный водой. Де- I тактирование, как и в системе 1; 4 — бумага ватман Л'і 1, пропитанная 0,1 М раствором гидрофосфата натрия. Подвижная фаза — бутанол, насыщенный водой,


Д

етектирование, как и в системах 1 и 2; 5 — бумага «для хроматографии» марки , пропитанная формамидом» Подвижная фаза — петролейный эфир, насыщен- " ный формамидом,

| *

конов и гликозидон. Наибольшие величины Rf могут быть получены при использовании системы — бензол, насыщенный метанолом для антрахинонов, а также систем 7—10 для антрагликозидов. Б ряду антрахинонов величина Rf падает с увеличением количества гидроксилов. Замена водорода гидроксильных групп на метильные радикалы больше сказывается на уменьшении Rlx чем ацетилирование гидроксилов.

Хроматографические данные линейных фурокумарниов [92, 227]
Соединение hlij в системах *,
1 2 3 4 5
Фуро-2', 3': 7,6-кумарин (псорален) 32 32 ___ „ 85 ___ ,
8-Метоксипсорален (ксантотоксин) 5 22 83 -- ---
5-Метоксипсорален (бергаптен)

5,8-Дішетоксинсорален (изопимии-

16 91 88
неллин)

8-Изоцентилоксипсорален (имнера-

12 ““
торин)

8-Окси-5-изопентенилисорален (алло-

21 72 91 92 40
императорин)

8-Изоиентилпсорален (изонмнерато-

- 0,5 - *
рин)

5 (2, 3-эиоксиизоиентилокси)-нсорален

47 88 '
(оксинеуцедашш)

5'-(2, 3-диокси-3-метилбутокси)-псора-

63 51 . -- *
лен (оксинеуцедашшгидрат) 4'-Метокси-5-прошілпсорален (пеуце- " 0,5 - *
данин) 88 50
5 '-П роп илпсо рален (аигпдромармезин) 5'-(2-оксиизопршшл)-4', 5'-Дигидро- " 86 “*
псорален (мармезин) 5'-(1-ангелоилокси-1-метилэтил)-4', 5'-Дигидрокеш ісорален (дельтоин) 5' -(1-сенеционил оксп-1 -метил этил )-4', б'-Дигадропсорален (пранчимгин) 1
82 —*
-- -- 91

* См, табл. 4,


У гликозидов увеличение количества сахарных компонентов оказывает наибольшее влияние на величину Rf.

Производные кумарина, как и производные антрахипона, лучше всего разделяются с помощью распределительной хроматографии с использованием бумаги, пропитанной этиленгликолем, пропиленгликолем, формамидом или 0,1 М раствором натрия гидрофосфата. Подвижная фаза: петролейний эфир или бензин, бутанол, насыщенный водой. Величины hRf производных кумарина обобщены в табл. 4—6. Детектирование проводят непосредственным наблюдением в УФ свете, а также после опрыскивания хроматограмм растворами щелочи, диазореактивами, реже реактивом Драгендор- фа. Различная подвижность, а также цвет флуоресценции позволяют идентифицировать кумарини, фурокумарини, ди- гидрофурокумарины. Оксикумарини* как правило* остаются

Хроматографические даппые янгулярных фурапо- и нираиокумяринов

|92, 166. 227]

bgcolor=white>—
Соединение hRj в системах *
1 2 3 4 5
Производные ангелицина

Фуро-2, 3 : 7, 8-кумарин (изопсора- лен, ангелицин)

4 58 18
б-Мотоксиангели шш 29
5'-(2-оксиизонропил)-Ангелши]н (оро- зелол] 45
4', 5'-Дигидро-5-сенециолорсші ропил- 4'-ацетилоксиангелицин (днфуро- кан, атамантин) 55
8-(2-окышзопропил)-8, 9-Дигидроанге- лицнн (лобанотин) _ 45
8(S), 9(Л)-9-Ацетилокси-0-сенециоло- кси-8, 9-дигидроорозелол (пеуцени- дин) 50
Производные сеселина

2, 2-Диметшншрано-5', 6' : 7, 8-кумарин (сеселин)

46
3'-а-Метилбутирилокси-4-ацетил-ок- си-3', 4'-дигидросеселин (виснадин) 80
* См, табл. 4, .


на старте в большинстве из приведенных в таблице систем, и только обработка бумаги формамидом в метиловом спирте или ацетоне позволяет увеличить подвижность и получить удовлетворительные величины HR). Фуранокумарини линейные лучше разделяются в системе 2, а ацгулярные — в системе 5, Систематические данные об ангулярных кумаринах в литературе отсутствуют.

Систематизация литературных данных [177—180, 227, 424] по применению хроматографии на бумаге для разделения флавоноидных соединений показала, что подавляющее количество исследователей в своей работе применяют в основном пять систем растворителей, состоящих ИЗ водных растворов уксусной кислоты и сочетания уксусной кислоты с /i-бутанолом, метакрезолом; реже используют етилацетат, насыщенный водой (табл. 7 — 11).

Е. Бейт-Смит и Р. Уэстолл [2271 при сопоставлении строепия флавоноидов и величии Rt в пяти системах вывели

Соединение hRj в системах *
1 2 3 4 5
Флаванон 98 55 81 98 73 '
7-Оксифлаванон 95 99
5, 7-Диоксифлапанон (пиноцембрин) 4', 7-Диоксифлаванон (ликвиритиге- 92 29 99
нин) 87 39 86 97 90
5, 6, 7-Триоксифлаванон 83 47 ___
4, 5, 7-Триоксифлаванон (парипгенпп) 3', 4', 5, 7-Тетрооксифлаванон (эрио- 88 33 88
дикшол)

4'-Метокси-3, 5, 7-триоксифлаваиоп (гомоэриодиктол)

З-Метокси-4', 5, 7-триоксифлаванои

84 39 16
90 55 80 97 96
(гесіюретип)

3, 3', 4', 5, 7-Понтаоксифлаванон

90 50 97 95
78 13 73 79 _
З-Метокси-4, 5-дцоксифлаваыон-7-0-
нсогеснеридозид

Ликвирнтигенин-7-Р-0-глюкопирано-

59 81 90 38 64
зил-б-Р-О-апиофуранозид (уралозид) Ликвиритигенші-4'-р-Г)-глюкоішрано- 45 60
зил-4-P-D-a п иофу ранозид (глабро- зид) 52 42
Ликвиритигенин-4 -p-D-глюкошірано- зид (ликвиритон)

Нарингешпі-7-О-неогесперидозпд (ва-

65 54
ренгии) 61 80 88 51 56
* Системы растворителей при хроматографировании флаванонов и флява- нонгликозидов на бумаге: 1 — н-бутанол — ледяная уксуснан кислота — вода (4:1: 5); 2 — ледяная уксусная кислота — вода (15 : 85); 3 — ледяная уксусная кислота — вода (60 : 40); 4 — этилацетат, насыщенный водой; 5 — л-кре- вол — уксусная кислота — вода (50 : 2 : 48).


ряд правил, устанавливающих зависимость между строением и хроматографическим поведением флавоноидов:

Rj снижается при увеличении количества гидроксильных групп в молекуле;

метилирование гидроксильных групп приводит к повышению Rf, так как величина групповой константы (Rm) для метоксилыюй группы значительно ниже, чем для гидроксильной;

ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению Rf,

глюкозидировапие обусловливает снижение Rf на величину, равную введению одной гидроксильной группы, На-

bgcolor=white>91
Соединение hHj в системах*
1 2 3 4 5
Флавон 92 0 99
З-Оксифлавон 89 26
5-Оксифлавон 91 15 98
4'-Оксифлавон 95
4'-Метоксифлавон 88 28 99
7-Оксифлавон 89 29 99
3, 4'-Оксифлавон 77 18
3, 4'-Диметоксифлавон 84 26 99
5, 7-Диоксифлавон (хризин) 90 16 75 86
5-Окси-7-метоксифлавон (тектохризин) 19 89 98
5, 6, 7-Триоксифлавон (байкалеин) 78 19 79 97
4', 5, 7-Триоксифлавон (апягешш) 4-Метокси-5,7-диоксифлавон (акаце- 87 И 66 87 88
тин)

3', 4', 5, 7-Тетраоксифлавон (лютеолин) 5, 6-Диоксифлавон-7-0-глюкуронид

90 44 71 94
77 8 63
(байкалин)

4'-Метокси-5-гидрокси-7-0-глюкозид

46 33
(акацетин-7-О-глюкозид)

3', 4', 5-Триоксифлавон-7-0-рутино-

58 27 ---- ----
вид

3', 4', 5-Триоксифлавон-7-0-глюкозид

26 30 ---- ,
(лютеолин-7-глюкозид)

4', 5-Диоксифлавон-7-0-рамноглю- козид (аиигенин-7-О-неогеспериде-

43 16
зид)

4', 5-Диоксифлавон-7-0-глюкозид (апи-

52 49 •— . 61
геиин-7-О-глюкозпд) * См, табл, 7, 61 23 73

личие двух сахарных компонентов в различных положениях дигликозидов снижает Rf больше, чем у биозидов.

Орто- и вициальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения Rf.

Идентификацию флавоноидных соединений, за исключением флаванонов и флаванонолов, не имеющих собственной окраски, можно проводить без обработки хроматограмм, однако для увеличения чувствительности и повышения избирательности методик хроматографического анализа используют реактивы, способные образовывать окрашенные соединения и флуоресцировать в УФ-свеге: 1%-й раствор хлорного железа в спирте или 2%-й водный раствор; 2%-й раствор хлористого цнрконила в метиловом спирте; 1%-й водный раствор ацетата свинца, 1 %-й спиртовый раствор хлористого алюминия и др, [425],

Хроматографические данные флавонолов и флавонолглюкозидов [227,

425]

Соединенно ЛКj в системах *
1 2 3 4 5
Флавонол (3 -оксифлавон) 89 26 _
7-Метоксифлавонол 90 99
3', 4'-Диоксифлавонол 84 80
4\ 7-Диоксифдавонол 80 6
5, 7-Диоксифлавонол (галантин) 88 И 75 98
4', 5, 7-Триоксифлавонол (кемпферол) 3', 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол (квер- 79 4 50 90 53
цстин)

3', 4', 5-Триокси-7-метоксифлавонол

57 3 40 81 23
(рамнетин)

4', 5, 7-Триокси-З-метоксифлавонол

03 4 60 92 69
(изорамнетин) 68 2 —.
2', 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол (морин) 3', 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол (роби- 76 76 68 71
нетин) 25 3 32 41
4', 5-ДиокситЗ, 6, 7-триметокспфлавон 3' 4', 5, 6, 7-Пентаметоксифлавонол 87 35 50 81
(кверцетагенин)

3', 4', 5, 7, 8-Г1ентаоксифлавонол (юс-

78 14 63 17
сипетин)

3', 4', 5', 5, 7-Пентаоксифлавонол (ми-

28 4 43 59 *-
рицетин) 29 1 31 78
Квсрцетип-З-О-рампозид (кверцитрин) 61 58 74 50 38
Кнерцетин-З-О-гала ктозид (гииерин) 43 43 38
Изорамиетин-З-О-ругшюзнд 72 46 74 40 21
Кверцетші-3-О-рутинозид (рутин) 44 56 75 15 18
Мирицетин-З-О-рамиозид (мирицетрин) 74 52 72 35
Кверцетии-3, 7-О-диглюкозид Компферол-З-О-рабнцозшіші-7-О-рам- 13 66 —-
нозид (робшшн) * См, табл, 7, 40 77 84 21 43


Большая чувствительность хроматографии на бумаге при идентификации флавоноидов, производных антрахипона и кумарина делает эти методики одними из наиболее приемлемых в качественной оценке суммарных фнтохимических препаратов и растительного сырья. Основным недостатком метода является большая затрата времени — от 5 до 36 ч, а в ряде случаев — и малая разделяющая способность, что требует проведения двумерного хроматографирования, а следовательно, усложняет и удлиняет время проведения анализа.

Хроматографические данные производных флаванопола

1425]

Соединение hRj в системах *
1 2
Флаванонол (дигидрофланонол) _ _
4', 7-Диоксифлаванонол

3', 4', 7-Триоксифлаванонол (ди-

87 52
гидрофизетин)

3', 5, 7-Триоксифлаванонол (ди-

75 63
гидрокемнферол)

3', 4', 5, 7-Тетраоксифлаванонол

86 48
(дигидроробинетин) * См, табл, 7, 86 58

Таблица 11

Хроматографические данные анализа халконоз и хал- конгликозидов [177—180]
Соединение hllj в системах *
1 2
2-Оксихалкон 94 25
4-Оксихалкон 93 24
2-Окси-З-метсксихалксн 93 9
3, 4-Дноксихалкон 87 26 ■
2, 2'-Диоксихалкон 94 17
2, 4'-Диоксихалкон 93 11
2, 3', 4'-Триоксихалксн 86 10
2, 3, 4-Триоксихалкон 84 16
2, 2', 4'-Триоксихалкон 97 9
2, 4', 4'-Триоксихалкон (изоликвпри- 87
тигенин)

2, 4, 3', 4'-Тетраоксихалкон

7
70 7
Изоликвиритпгенин-4-О-глюкозид (нео-
изоликвиритии) 58 22
Пзоликвиритигенин-4-О-глюкозид
(изоликвиритии) 52 15
1Ізоликвиріпигеніш-7'р-Оглюкоішра- позил-2-Р-0-апифуранозид (ликура-
зид) 45 20
ИзоликБиритигенин-4-р-и-глюкопира- цозил-б-р-О-апифуранозид (изоура-
лозид) 45 20
Изолигашритигснин-4-Р D -глюкоппра- нозпл-4- P-D-апифураыозиа (изоглаб- 15
розид) 37

* См, табл. 7.


Хроматография в тонких слоях сорбента

Недостатки метода хроматографии на бумаге, отмеченные выше, легко устранимы при использовании метода хроматографии в топких слоях сорбента (ХТС). Преимущество данного метода перед хроматографией на бумаге не только в быстроте, по и в более четком разделении (меньшем расширении пятен), возможности открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными проявителями при повышенных температурах.

В 1939 г. в журнале «Фармация» была опубликована статья сотрудников Харьковского НИХФИ Н. А. Измайлова и М. С. Шрайбер «Капельпо-хроматографический метод анализа и его применение в фармации» [114]. В данном сообщении впервые в мире были изложены основы хроматографии в тонком слое сорбента.

Остается только сожалеть, что практическое применение этот прогрессивный метод нашел лишь в 50-е годы (311J, Сегодня невозможно представить химию биологически активных веществ, как и любую другую область химии, без ХТС. По данным N. Macek, I. М. Heis [426], только за период с 1970 по 1975 г. в области ХТС было опубликовано более 8 тыс. работ — по теории и методологии ХТС, разделению, идентификации и количественному определению в сочетании с различными физико-химическими методами [403]. Более 70 % публикаций приходится на анализ активных соединений.

Развитию в нашей стране ХТС для анализа биологически активных веществ способствовали исследования, выполненные в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля лекарственных средств [299, 300], 1-м Московском медицинском институте им. И. М. Сеченова [128], Всесоюзном научно-исследовательском институте фармации [42], Институте ботаники им. В. Л. Комарова АН СССР [166, 167], Всесоюзном паучно-исследователь- ском институте химии и технологии лекарственных средств [69, 75, 80, 82, 84, 85], Институте химии растительных веществ АН УзССР [62, 63, 273, 313], Институте фармакохимии им. И. Г. Кутателадзе АН ГССР [127], Всесоюзном институте лекарственных растений [158, 160].

Б. Г. Беленький и соавторы [24] разработали теорию ХТС и вывели основное дифференциальное уравнение, учитывающее влияние скорости движения элюента, диаметра зерен сорбента, величины начальной зопы на величину Rf и формирование зоны,

При выборе сорбента речь, главным образом, идет о величине и форме зерен, толщине слоя и соответствующем связывающем веществе.

Работы последних лет показывают, что наиболее часто (свыше 80 %) в качестве сорбента используется силикагель, на втором месте целлюлоза (10 %), а остальные 10 % приходятся на оксид алюминия, полиамид, тальк и другие сорбенты [426]. Поэтому неудивительно, что наибольшее внимание при выборе сорбента уделено силикагелю. В настоящее время производится более 100 различных марок силикагелей, которые значительно различаются по своим хроматографическим свойствам.

Для сорбционных свойств силикагеля существенно важны величина пор, качество поверхности и степень насыщения силановых групп. Вторичные признаки, такие как величина частиц и их распределение, играют очень важную роль. Б. Г. Беленьким с соавторами [24] сделан вывод, что для ХТС оптимальная величина частиц находится в диапазоне 2—7 мм, т. е. в более узком диапазоне, чем у применяемых на практике сорбентов.

Работами сотрудников отдела изучения качества лекарств венных препаратов ВНИИХТЛС (А. Л. Литвиненко, Г. Ф. Федориным, Е. И. Пучковой) показано, что оптимальная величина частиц силикагеля для разделения флавоноп- дов и антрахинонов — 100 нм, сердечных гликозидов, терпе- ноидов, производных кумарина — 50 нм [69, 75—80, 127].

На скорость потока и чувствительность детектирования влияет толщина слоя сорбента, которая, по ранее отмеченным данным, составляет для карденолидов, буфадиеноли- дов, терпеноидов и кумарннов 100 нм, а для антрахинонов и флавоноидов 150—200 нм.

Необходимо отметить, что с выпуском готовых стандартных пластин практическое применение ХТС значительно расширилось, а воспроизводимость результатов приобрела стабильность.

Метод ХТС включен как раздел общей статьи «Хроматография» в Государственную фармакопею СССР X издания (ГФ X). Однако в частных статьях ГФ X этот метод использовался до 1972 г. крайне редко. С 1972 г. метод включен более чем в 100 фармакопейных статей как при пересмотре действующей документации, так и при разработке ВФС на новые препараты.

Техника хроматографирования, методики приготовления различных сорбентов и результаты качественного и количественного анализа биологически активных веществ расти-

Хроматографические данные производных аптрахинона [58, 389,

416, 437]

Соединение Силикагель Полиамид
hRj в системах *
* 2 3 4 5 6 7 8 і 9 10
Франгулаэмодип 83 81 70 _ 85 51 91
Хризофановая кислота 92 92 88 67 95 84 94 47
Фисцпоп 62 71 30
Рейн 0 2 3 -- .
Фаллаципол-1, 8-диоксп-6-мето-
кси-3-метилантрахннон 35 80
Фаллацинол (1, 8-диокси-6-ме-
токси-З-метилантрахиноп) 35 36
Париетиповая кислота 76 36
Цитреорозеип 13 30
Эмодиповая кислота 10 8
Реумэмодип 39 12 -- .
Алоээмодпн 34 34 46
1-Оксиантрахипоп 98 89
1, 2-Диоксиантрахинон 93 69 53
1, 4-Диоксиантрахинон 93 91
1, 5-Диоксиантрахинон 79 81
1, 8-Диоксиантрахинон 91 87
1, 2, 4-Триоксиантрахішоп 65 72
Фраигулин 52 46 40 65 6 22 -- .
Глюкофрангулин 6 7 4 2 0 -- .
Аллоип ~ ' 89 ' ’ ' ___
* Системы растворителей при хроматографировании производных антрахи- нона в тонком слое силикагеля и полиамида: 1 — бензол — метанол (8 : 2); 2 —. хлороформ — метанол — метилэтилкетон — ацетил — ацетон (70 : 10 : 5 : 1);

3 — бензол — метанол — метилэтилкетон — ацетил — ацетон (70 : 10 : 5 : 1); 4— гексан—атилацетат (70 : 30); 5 — петролейний эфир — толуол — диоксан — метанол (80 : 20 : 20 : 20); 6 — четыреххлористый углерод — метанол (10 : 2); 7 — этилацетат — метанол — вода (100 : 16,5 : 13,5); 8 — хлороформ — метанол —

метилкетон — ацетилацетон — муравьиная кислота (70 ; 10 : 5 : 1 : 1); 9 — бен- вол — атилацетат — уксусная кислота (8:1:1); 10 — ацетон — уксусная кислота (9 : 1).


тельного происхождения подробно описаны нами в двух монографиях [78, 127] и брошюре [70], поэтому в данном разделе не обсуждаются.

Величины hRf для ряда флавоноидов и производных кумарина, антрахинона обобщены в табл. 12—17.

Одновременно приводим методы предварительной идентификации кумаринов, флавоноидов и антрахинонов в растительном сырье.

hftj окспантрахинонов при обнаружении реактивом « 1%-й раствор едкого кали в этаноле» [302]
Вещество Положение загрести- те лей Сорбент и системы растворителей * Встречается в сырье**
R3 R6 А Б В г д
Хризофанол —сн3 73 ___ _ 70 47 (1), 2, 3, 4, 7
Фисцпон —сн3 -0СН3 66 55 30 (5), (6), 7
Франгулаэыо-
дин -СНз -ОН 61 52 17 12 2, 3, 4, 5, 6, 7
Алоээмодин —СН2ОН —н 35 79 46 1, 2, 4, 5, 6, 7
Ренн -соон —н 49 40 26 3 (1), 5, 6, 7
1, 8-Дпокспант-
рахинон —н —н 53

* А — силикагель; бензол — этилформяат (9:1); Б — силикагель; бен- 80Л — этилформиат — муравьиная кислота (15:5:1); В — силикагель; этил- ацетат — метанол — вода (100:17:13); Г — силикагель: пертолейный эфир (т, кип. 40—70 °С) — этилацетат (9 : 1); Д — полиамид MN; бензол—метанол (2 : 8), ** 1 — алоэ; 2 — хризаробин; 3 — кора Frangula\ 4 — кора Rhrammns pursft; 5 — цветки Senna', 6 — плоды Senna', 7 — Radix rhel. В скобках приведены природные источники, содержащие малые количества антрахинонов.


Метод предварительной идентификации кумаринов и фу- ранохромонов в растительном сырье. К навеске (2—5 г) измельченного растительного сырья (плоды амми зубной или корни горного или днепровского горичника) прибавляют 100 мл 50—70%-го спирта, смесь нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 1—2 ч, переносят в делительную воронку, прибавляют 200 мл воды, 3 раза по 15 мл хлороформа или смеси хлороформ — этилацетат (2 : 1) и встряхивают воронку. Хлороформный слой фильтруют в круглодонную колбу со шлифом, растворитель отгоняют досуха, а остаток растворяют в 5—10 мл смеси хлороформ метанол (2 : 1).

Условия хроматографирования следующие. Сорбент: окись алюминия нейтральная. Системы растворителей с относительным составом компонентов: С-1 — петролейный

эфир — этилацетат (2 : 1); С-2 — бензол — этилацетат (2} : 1); С-3 — циклогексан — этилацетат (3:1). Выделенные кумарины и фуранохромоны наносят на три пластины по пять пятен извлечения (0,2—0,5 мл в каждой пробе)* Расстояние пробега растворителя 250 мм.

После хроматографирования пластин в системах растворителей С-1, С-2 и С-3 проявляют зону первого пятна —

Хроматографические данные производных кумарина [10, 481] bgcolor=white>76
Соединение Силика

гель

/іНу

В Силикагель — целлюлоза

системах *

і Г 2 2' 1 Г 2 2'
Кумарин 55 96 75 96 68 93 98 99
З-Оксикумарин 55 93 70 98 65 88 96 92
З-Карбооксикумарин 47 80 60 98 59 66 88 99
4-Оксикумарин 75 65 27 63 54 51 59 93
5-Оксикумарин 45 79 30 92 52 52 72
6-Оксикумарнн 43 03 25 66 44 68 49 65
7-Оксикумарин (умбеллиферон) 45 43 44 27 44 61 61 56
7-Пропоксикумарин 05 95 92 99 74 95 97 98
7-Пропоксикумарин-З-карбоновая кислота 60 94 87 97 67 92 90 99
8-Метоксикумарин (герниарин) 55 97 80 86 94 95 98 99
6, 7-Диоксикумарин (эскулетин) 28 28 8 4 40 43 15 15
7, 8-Диоксикумарин (дафнетин) 42 30 20 28 44 34 35 36
б-Метокси-7-окспкумарин (скополетин) 42 67 66 84 46 54 83 96
4-Метил-5-метокси-7-оксикумарин 47 57 35 72 41 79 80 94
4-Метил-5, 7-диметоксикумарип 53 92 81 98 65 99 98 99
5'(2-оксиизопропил)-ангелицин (орозелол) 62 84 93 99 73 95 98 95
4'-метоксн-5'-нроііиліісорален(иеуцеданин) 56 88 91' 98 63 97 98 99

* Системы растпорителей при хроматографировании производных кумарина в тонком слое силикагеля и полиамида: 1 и 1' — толуол — этилформиат — муравьиная кислота (5:4: 1); 2 и 2' — хлороформ — уксусная кислота —вода (4:1: 1). Штрихом обозначено, что сорбенты силикагель или силикагель + целлюлоза насыщены парами воды»


5%-м спиртовым раствором соляной кислоты, второго — аминоантипириновым реактивом и зону третьего пятна — 5%-м спиртовым раствором едкого натра. Зоны чертвертого и пятого пятен в районе старта элюируют метанолом, наносят по четыре пятна на каждую пластину и хроматографируют, используя сорбент (окись алюминия кислая). Системы растворителей с относительным составом компонентов: С-4 — циклогексан — этилацетат — метанол (12 : 14 : 1) и С-5 — циклогексан — этилацетат — метанол (3:2:1). Проявляют пятна реактивами, указанными выше.

Этой методикой были идентифицированы гидроксилсодержащие кумарини (скополетин и умбеллиферон), ацети- лированные дигидропроизводные 7, 8-фурано- и 7, 8-пира- нокумарина (пеуценидин, атамантин, впснадин) в горични- ках горном, днепровском, амми зубной и фуранохромоны в амми зубной.

Описанная методика может быть рекомендована для исследователей в области фитохимии, биосинтеза и локали-

аации кумарппов и фуранохромонов в растительном сырье, так как она позволяет установить наличие этих соединений в сырье без их выделения и без применения свидетелей.

Метод предварительной идентификации антрахинонов в растительном сырье. 1. Навеску (5 г) измельченного сырья коры крушины ломкой экстрагируют в аппарате Сокслета 70%-м этанолом. С целью предотвращения гидролиза гли- козидов добавляют 1 % ингибитора — лактона глюкуроно- вой кислоты. Полученный этанольный экстракт переносят в круглодонную колбу, растворитель отгоняют досуха, а остаток растворяют в 10 мл метанола, после чего добавляют 10 мл хлороформа.

Условия хроматографирования следующие. Сорбент — незакрепленный слой силикагеля КСК. Нанесение антрахинонов — на пластину размером 25x30 см наносят полоской 0,1 мл извлечения. Расстояние пробега растворителя 250 мм.

При проявлении хроматограммы в УФ-свете до и после обработки парами аммиака для глюкофрангулина наблюдается оранжевая окраска пятен, франгулина — желтооранжевая или желтая, хризофановой кислоты — желто- зеленая.

Система растворителей: бензол — метанол (8 : 2). Можно применять и другие системы растворителей, приведенные в табл. 12, 13.

2. Навеску (0,1 г) измельченного сырья листьев или плодов сенны помещают в колбу вместимостью 100 мл с обратным холодильником, прибавляют 35—40 мл 70%-го этанола и кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин. По охлаждении раствор фильтруют.

Так как деление гликозидов не всегда удовлетворительное, то рекомендуется до хроматографии проводить кислотный гидролиз и окисление. Для этого 0,1 г измельченного порошка листьев или плодов сенны помещают в колбу вместимостью 100 мл, смешивают с 5 мл 10 н. серной кислоты, 1 мл 30%-й перекиси водорода и кипятят 1 мпн. По охлаждении взбалтывают с 5 мл бензола или эфира в делительной воронке. Бензольный или эфирный слой отделяют, растворитель упаривают до 1 мл.

Условия хроматографирования: на пластину «Силуфол TJV-254» наносится 0,01 мл полученного экстракта.

Системы растворителей: этилацетат — н-пропанол — вода (4 : 4 : 3).

Для более четкого разделения сеннозидов А и Б пятен проводят двухступенчатое хроматографирование: вначале на длину 5 см в системе н-бутанол, насыщенный водой, а после

Таблица 15

hRf, флуоресцепция и цветные реакции кумарипов и фуранохромопов [70, 81, 851

Кумарини и фурано- хромоны ft Я f в системах Сорбент Цвет флуоресценции Окраска пятен кумаринов и фуранохромонов
до обработки пластин б %-м спиртовым раствором едкого натра после обработки пластин 5 %-м спиртовым раствором едкого натра
1

О

C-J

1

О

оо

і

О

"f

О

хП

6

5 %-м спиртовым раствором соляной кислоты аминоантипири- новым реактивом
1 2 3 4 й 6 7 8 9 10 и
Кумарин 69 54 80 45 76 Окись алюми- «—т Зеленый _
6-Мстиокумарин 69 54 80 45 76 ни я нейтральная
Остол 69 50 80 42 70 Голубовато- Зеленовато-жел-
фиолетовый тый
ІУмбеллип ренин 75 53 81 46 75 То же То же Зеленовато-голу

бой

Псорален 61 40 81 35 62 )) Голубой Голубой
Ксантотоксин 54 25 75 28 51 )> Зеленовато- Оранжевый
желтый
Бергаптен 60 47 81 36 63 $> То же Зеленовато-жел-
тый
Изопимпинеллин 56 28 80 30 53 )> Темно-желтый Желтый
Императорин 60 30 85 35 59 » Желтый »
Ангелищш 70 48 S4 42 70 » . Голубой Зеленовато-жел-
ТЫЙ
Сфопдин 50 20 77 28 48 а Голубой



bgcolor=white>4
Изобергаптсн 75 45 83 45 71
Ппмпинеллин 72 37 80 43 67
Пеуцснидип 53 10 79 28 44 »
Атамантин 68 20 86 35 69
Виснадш 53 10 76 27 45
Дягидросампдпн 53 10 76 26 45 5>
Птерпксип 47 15 72 25 41
Неллин 40 5 61 15 30
Умбеллиферон 6 33 52 17 83 Окись алюми
Скополетин 5 21 39 62 74 ния кислая
Фраксннол 6 32 47 77 80 То же
Пеуценол 17 49 70 80 90
Острутпп 15 48 70 80 87 • »
Фарпезиферол А 2 19 55 32 87
4-Оксикумарпн 21 50 70 86
4, 7-Диокси-5-ме- тилкумарин 0 0 16 58 73 »
4, 7-Диоксикума- рш 0 0 16 58 73 5>


Зеленовато- Зеленовато-жел I
желтый тый _
Темно-желтый

Голубовато-

Желтый

Зеленый

■—1
фиолетовый
То жо »
Голубой » —■
Голубовато » _
фиолетовый
То же
Желтый Темно-желтый Желтая
Голубой Голубой
» » __
Темно-желтый Желтый
Голубой Голубой
»

Голубовато-

»

Гол у бовато-фио ле

фиолетовый то пый '—■
Голубой Голубой Фиолетовая
» Красная
» »


1 1 2 3 1* 1 5 6 1 ’ 8 1 9 10 И
б-Окси-1-мстилку- Окись алюми- Голубовато- Оранжевый
марин 0 30 48 75 80 ния кислая зеленый
Дафпетип 0 9 15 52 80 То же Голубовато-зсле- —.
ный
Дафпин 0 0 0 0 12 Темно-желтый Желтый Красная
Эскулетин 0 0 16 47 75 » Желтый »
Эскулин 0 0 0 0 15 » Голубой Голубой
Берга птол 5 28 45 79 86 » Желтый Желтый Зеленая
Ксантогалол 5 43 49 74 90 » Голубовато- Голубовато-фио- Фиолетовая
фиолетовый летовый
Келлолгликозид 0 0 0 0 10 Желтый Желтый Желтая
Кел л ол ксантоток- 7 39 56 80 84 » Темно-желтый Зеленев ато-жел - —ч
СОЛ тый
Келлактов 0 6 18 56 36 » Голубовато- Голубовато-фио- г ,
фиолетовый летовый
Томаяип 3 17 33 69 89 Желтый Желтый .__ . —Ч
Остру тол 15 29 38 78 89 »
Еиакапгелицип 0 0 22 54 74 » Темно-желтый Темно-желтый
Геракол 17 49 74 0 90 » Голубовато- Голубовато-фио-
фиолетовый летовый
Мармезин 17 49 74 0 90 » То же То же
Нодакенитнр 17 49 74 80 90 » »
Примечание, В графах 2—6 предстаплепы ?значения hRf кумаринов и фураяохромонов в системах растворителей С-1, С-2, С-3, С-4, С-5, hRf = R^‘100. Прочерк означает отсутствие флуоресценции, а также окраски кумариаоп и фураяохромонов с паяными реактивами; hRl = о означает, что соединение остается на старте при хроматографировании в данной системе растворителей.




Хроматографические данные флавоиоидных соединений [70, 78, 79,

176, 194]

Соединение hlij в системах *
1 О 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и
Флаесны

4' 5, 7-Триоксифлавон (апигснин)

68 54 48 69 51 71
4'-Метокси-5, 7-диокснфлавои (ака- цетин) 69 58 48 63 68 72 52 77
3', 4', 5, 7-Тетраокспфлавон (лю- теолин) 20 15 25 85 82 8 6 18
5, 7-Диокспфлавон (хризин) 52
Фла еонгликозиды Апигєнин-7-О-глюкозид (апипн) 12 5 13 76 64 3 2 9 55
Лютеолин-7-О-глюкозид 18 12 IS 79 76 6 6 4
Флавансны

4', 5, 7-Триоксифлаванон (нарнн- генин)

46
Флаеанснгликозиды

Нарингонин-7-О-неогесцеридозид

(нарпнгпн)

41
Флаеонолы

4', 5, 7-Триоксифлавонол (кемпферол)

3', 4'. 5, 7-Тетраоксифлавонол . (кверцетин)

64 46 41 86 90 58 45 62 63 40
54 37 36 89 90 44 28 5! 28
4', 5, 7-Триокси-З-метокснфлаво- нол (изорамнетин) 64 50 44 77 89 63 50 65
3', 4', 5', 5, 7-Пентаокспфлавонол (мирицетин)

2', 4', 5', 7-Тетраокспфлавонол (мо- рин)

3,4', 5, 7-Тетраоксифлавонол (робив етин)

4 2 7 62 49 1 5 3 _ _
12
8
Флаеснолгликсзи ды

Кверцетпн-З-О-галактозид (гипе- рин)

14 и 23 78 74 3 3 15 71
Кверцетин-З-О-рамвозид (кверцет- рин) 18 12 24 81 81 7 4 20
Кемпферол-З-О-рамиозид 30 22 32 82 83 И 7 26
Кверцетин-3-0-ГЛЮКОЗНД 18 12 26 79 80 5 4 18
Мирицетпн-З-О-глюкозид 14 7 17 86 77 4 6 13



1 1 ■) ■ч Г> 6 7 ь 9 ■ 10
Кемііфррол-З-О-рнбшюзші-7 О рамнозид (рабшшн) 2 2 7 51 51 1 2 2 16
Кверцетпн-З-О-рутшгогид (рунні) 5 4 14 68 64 2 1 4 28 *—*
* Системы растворителей при хроматографировании флавонопдных соединений в тонком слое силикагеля: 1 — хлороформ — метанол — метилэтилкетон — ацетчлацетон (70 : 10 : 5 : 1); 2 — бензин — метанол — метилэтилкетон — ацо-

тилацетон (70 : 10 : 5 : 1); S — бензол — метанол (8 : 2): 4 — этилацетат — му- ракытзн кислота — кода (10 : 4 : 1); 5 — хлороформ — уксусная кислота — вода (10 : 4 : 1); 6 — хлороформ — уксусная кислота (5 : 2): 7 — бензол — уксусная кислота (5 : 2); 8 — хлороформ — метанол — метилэтилкетон — ацетилацетон — муравьиная кислота (70 : 10 : 5 : 1 : 1); В — этилацетат — метилэтилкетон — муравьиная кислота — вода (S0 : 30 : 10 : 10); 10 — бензол — этилацетат (75 : 2,5).


высушивания иа второй ступени я- пропанол — этанол — хлороформ — вода — уксусная кислота (40 : 40 ; 12 : 16 :4).

Величины hRf приведены в табл. 12, 13.

Хроматограммы проявляются в УФ-свете до и после обработки парами аммиака.

Газожидкостная хрома то гра фи я

Преимущество газожидкостной хроматографии заключается в возможности определения качественного состава и количественного содержания разделенных компонентов, а также автоматизации процесса контроля.

При качественной характеристике используют величину относительно времени удерживания (£отн), приняв за стандарт одно из хроматографируемых веществ. С этой целью Г. А. Кузнецовой [164 , 215 , 301] проведено исследование 32 природных кумаринов на набивной колонке с неподвижной фазой SE-30 (3 %) на газ-хроме Q (100—200 меш). Скорость потока газа-носителя аргона 150 мл/мин. Температура работы колонки 200 °С. Для измерения относительного времени удерживания в качестве стандарта взято время удерживания остола.

Величины /0тн позволили автору сделать выводы о поведении кумаринов. Установлено, что И 4 Г» 6 Ї & 9 10 а 12 1 3 4 0 Л 8 •1 10 11 12 13 Флаваноны 4', 5 7-Триокшфлаванон (яарингеяин) — — — — 80 77 — — — — — — Флаванонгликозид ы bgcolor=white> Нарішгенин-7-О-неогесперн- 34 дозид (яарпнгин)

Н а рішгенин-7-O- ру тинознд 31 — * — (гесперплин)

Нарингеяпн-4'-глюкозндо- .-т- " ні

81 43

21 - ~~ 7-О-неогесперидозпд

Нарянгенин-4'-глюкозидо- ■ ~ 35 27 7-О-рутинозпд — — — — — — — — — — Флавоны Аппгенпн 76 46 93 Лютеолпн 63 16 62 Акацетпн 86 92 100 Флавоноли Рамнетин 54 39 72 Физетия 48 9 45 Кверцетин — 12 37 И 32 Кемпферол — — — — — — — — 70 52 34 58 Морин 66 19 57 Мирицстнн

Роонпетнн 20

33 4

5 15

22 Изорамнетин 54 46 72 Флавоноле ликозиды Кемпферол-З-О-рамнозид 22 22 15 Кемпферол-3-0 -арабияозид 22 22, 15 Кемпфе рол-3-0 і люкозид 22 22 15 — Кемпферол-З-О-ксилозид 45 22 15 bgcolor=white>25 Кверцешн-З-О-рамнозид 22 22 15 25 — — — — —- — — — Кверцетия-3-0 -араби нозид 36 22 15 20 Кверцетин-З-0-г.іюкЬзид Кемпферол-З-О-рамяоглюко- 22 99 15 аид 32 37 27 Кемпфе рол-3 -О-днклюкозид Квердетин-З-О- рамноглю- 39 51 32 — — — — — — — — — козпд 32 39 29 Кемпферол-З, 7-0-диглюко- адд ■ 57 63 53

2*


85

1 | 2 А 4 fl К 7 8 10 п 12 13
Кверцетин-З-О-рамноглюко-

8ил-7-0-рамнозид

Кемиферол-З-О-рамногадак-

72 57 '2
66 68 00
тознл-7-О-рамнозпд Мирицетіш-3-О-рамноглико- зпл-7-О-рамиозид Кверцетпн-3- О-ру гинозид 30
72 67 62
(рутин) 45 —1
Флаеанонол ы
5, 7, 4'-Триоксифлаванонол
(аромадендоин)

5, 7, 3', 4'-Тетраоксифлаво-

88
пол (токсифолин) ~ —— —— 42 —» ——
* Системы растворителей при хроматографировании флавоноидных соединений в тонком слое полиамида: 1 — етанол — вода (3 : 2); 2 — вода — этанол — ацетплацетон (4:2:1); 3 — вода — этанол — бутанол — ацетилацетон (13 : 3 : : 3 : 1): 4 — хлороформ — метанол —- метилэтилкето'н исследователей [367, 488] показана возможность идентификации 20 оксикумаринов и 6 фурокумарипов на колонке с 1,5 % неподвижной фазы SE-30 на хромосорбе VV (60—80 меш) и 12 % диэтнлгликольсукцнната на газ-хроме Р (800—100 меш). Эти же условия хроматографирования применены для 22 флавоноидов с целью определения времени удерживания [357]. Среди исследуемых флавонов, фла- вонолов, флаванонов, флаванонолов, халконов и изофлаво- нов иаііболее длинные /отн имеют флавонолы. Отмечено, что

количество гидроксильных групп увеличивает tCT„. При равных количествах гидроксильных групп у флавапопов большие величины (от„ имеют вещества с гидроксильными группами в ортоположениях по сравнению с соединениями, имеющими оксигруппы в метаположепии. При равном количестве гидроксильных груип (три) в кольцах А и В /0тн больше у соединений с тремя гидроксилами в кольце А. Размыкание лактонпого кольца увеличивает время удерживания. Описаны условия хроматографирования силильных производных флавоиоидов на хромосорбе WAW-DMCS с 3 % SE-52 [340).

Канадскими авторами [437] исследовано 36 метиловых эфиров, флавонов, флаванонов, изофлэвонов и халконов на колонках с 5, 10 и 15 % SE-30 на хромосорбе при скорости газа-носителя гелия 100—150 мл/мин. Показано, что tOTH возрастает с увеличением числа заместителей при ацетилировании оксигрупп н наличии двойной связи в гетероциклическом кольце. При метилировании оксигрупп и образовании внутримолекулярной водородной связи tOT„ снижается. Время удерживания изофлавоноидов меньше, чем у флаао- нов и флааанонов. Некоторые флаваноны в условиях хроматографирования изомеризуются в соответствующие халконы.

Исследовано поведение 18 оксипроизаодных антрахинона и их тримегилсилильных эфиров при 240 °С на колонке 2,25x4 мм, заполненной 1,5 % силикона SE-30 на хромосорбе VV (60—80 меш) при скорости газа-носителя азота

110,5 мл/мин с пламенно-ионизационным детектором [356]. Показано, что /стн увеличивается с возрастанием числа акси- групп в ядре оксиантрахинонов; а-производные имеют t0Ta меньше, чем (1-производные. Время удерживания возрзстает в ряду а, а-; а, (3-; §, Р-диоксиантрахинонов. При введении в ^-положение оксиантрахинонов метильной, метоксильной и карбонильной групп t0TB возрастает с введением перечисленных групп в указанном порядке.

Триметилсилильные эфиры 19 производных хризофановой кислоты [351] и другие антрахиноны, содержащиеся в экстрактах ряда растений [339, 425], разделены на стеклянных колонках 210x0,3 см, заполненных 3 % SE-30 [351], 3 % OV-17 и OV-210 (1 : 1) [339, 428] на газ-хроме Q (80- 120 меш). Газ-носитель азот имеет скорость 30—60 мл/мин. Детектирование с пламенно-ионизационным детектором.

Различие во времепи удерживания трнметплсилильных производных флавоиоидов по сравнению со стильбенами, фенолоксикнслоіами и лигнанами позволяет проводить анализ флавоиоидов в присутствии указанных классов соединенна [183, 262],

Описана оригинальная методика количественного определения производных кумарина: ниснадипа и дигидросамидина в смесях. Методика заключаетси п том, что образовавшиеся после спиртового гидролиза смеси 2-метилмасляной (из вис- падина) и пзовалерпановой (из дигидросамидина) кислот разделяют на хроматоне NAWHMDS с 20 % бигеновой кислоты и 0,4 % фосфорной кислоты [116]. Количественную оценку проводят, как п в случае препаратов бероксан, пастпнацин, аммпфурни, псорален [212], по величинам площадей под пиком методом внутренней нормировки с использованием коэффициента пересчета для каждого из веществ.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ КАРДИОСТЕРОИДОВ ПО ДАННЫМ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ II В ТОНКОМ СЛОЕ

Хроматография на бумаге

Обнаружить сердечные глпкозиды непосредственно на хроматограммах без предварительной обработки реактивами не представляется возможным, так как они не окрашены и не флуоресцируют в ультрафиолетовом свете. В основу детектирования сердечных гликозидов на хроматограммах положена их способность взаимодействовать с реактивами с образованием окрашенных или флуоресцирующих соединений. В качестве реактивов применяют 3, 5-дпнитробензой- ную кислоту, лі-динитробензол, хлорид сурьмы.

Для разделения сердечных гликозидов A. Rheiner с соавторами [4С0] применяли систему и-бутанол — толуол (I : 1), а в качестве подвижной фазы служил формамид [490]. Эта система растворителей может быть пригодной для ыалополярных гликозидов. Для сильнополярных гликозидов она непригодна, так как скорость движения фронта растворителя незначительна. Е. Shenker и соавторы [464] нашли, что хорошего разделения гликозидов можно достигнуть в случае, если вода является постоянной фазой (неподвижной), а н бутанол — хлороформ — подвижной. В этой системе применяли к-бутанол, насыщенный водой. Нижняя фаза служила для пропитывания бумаги, верхняя — для хроматографирования. Хроматографическую бумагу' обрабатывали формампдом, затем протягивали через воду, насыщенную бутанолом, оставляли на 10 мин в висячем положении для стекания и, наконец, отжимали между листами фильтровальной бумаги.

A. Kaiser [390] применил в качестве системы для хроматографирования тетрагидрофуран — хлороформ — формами*!, а Т. Reichstein с сотрудниками 1457 ] — к-бутанол — толуол — вода (1:1: 2). R. A. F. Laufke [414, 415] предложил для бумажно-хроматографического разделения как сырья, так и настоек систему хлороформ — вода — изоами- ловый спирт, а хроматографирование проводил в водной фазе. Время хроматографирования — 10 ч. 11. Erbring ц соавторы 1348), применив круговую хроматографию, разделили семь глпкозидов ландыша майского. Реактивом для проявления служили реактив Кедде [399, 45G] или Раймонда [452], а также насыщенный раствор треххлорпстоп сурьмы в хлороформе п концентрированная серная кислота. Было получено девять зон при обработке треххлористой сурьмой и семь зон при обработке реактивом Раймонда.

A. Elbanowska [344] разработала хроматографический способ разделения на бумаге карденолидов ландыша (соцветие, лист, цветоножка) для сырья и для получаемых из него галеновых препаратов. Хорошее разделение карде- нолпдов достигнуто в двух системах нисходящим способом на бумаге Шлепхер-Шюль 2045 с применением подвижной фазы этилацетат—хлороформ—метиловый спирт—0,9%-й хлористый натрий (10 : 5 : 3,5 : 1,5) и с применением подвижной фазы хлороформ — диоксан — бутиловый спирт — формамид (70 : 20 : 5 : 5). В обоих случаях па хроматограммах получили по восемь пятен для сырья, по семь — для настойки, по шесть — для стабилизированного экстракта п по пять — для настоя.

Хорошее деление достигнуто при использовании бумаги ватман № 3 нисходящим способом в системе Питра: хлороформ — диоксан — бутиловый спирт — формамид (70 : 20 : : 5 : 5). Бумагу пропитывали в системе формамид — метанол (1 : 4), при этом было получено шесть пятен [344].

Из изложенного следует, что для идентификации сердечных глпкозидов в сырье и препаратах применяют метод хроматографии на бумаге, который по чувствительности превосходит другие. Недостатком метода является длительность процесса разделения, а также невозможность применения агрессивных проявителей.

Хроматография в тонком слое

Фундаментальные исследования по хроматографии в тонком слое ХТС силикагеля кардиосгероидов проведены Новером с сотрудниками (цит, по [302])д у нас в странр 7-


bgcolor=white>Строфавтидив
Заместитель
Вршрство в, В, в» R* В,
1 2 3 і 5 6
НСО ОН ОН СН3 он
3-9пистрофантидин исо -он ОН сн3 он
Конваллятокспн НСО a-L-Рамноза он сн, он
Дезглюкохейротокспн НСО P-D-Гулометилоза он СН3 он
Строфантпдпн-3-P'D- НСО p-D-Глюкоза он сн, он
глюкоза'
Строфанта дгш-З-сс- L- НСО a-L- АрабпвОза он сн3 он
арабинова
Строфа нтидин-3-a-D- НСО a-D-Арабиноза он сн, он
арабивоза
Строфа нтидпн-3-p-D- НСО P-D-Ксилоза он сн3 он
ксилоза
Эризимин ПСО P-D-Дигитоксоза он сн, он
Цимарин НСО P-D-Цимароза он сн3 он
Корхорозид А НСО Р D-Бовиноза он сн, он
Конваллозпд

Эрпхрозпд

НСО

НСО

а- L-Рамноза -Ь + p-D-глюкоза P-D-Дигитоксо- за + P-D-кси- лоза он сн3 он
Скорппозпд НСО Глюкоф у раноза он сн3 он
К-строфаптпн-Р НСО P-D-Глюкоза +

+ P-D-цимароза

он сн3 он
Эричимозид НСО p-D-Дигитоксоза он Сіі3 он
К-строфаитозид НСО p-D-Цішароза + + p-D-глюко- за + a-L-глю- коза он СН, он
Глюкоэрпзимозпд НСО P-D-Дигитоксо- за + 2a- L-глюкозі он сн

3

он
Хішрантозид НСО P-D-Гулометп :оза н сн3 он
Коротоксигсннп НСО ОН сн5 он
40


ГЛИКОЗІІДОВ

систем.I * bgcolor=white>_
Н, R, R. R. 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 \z 13 Гі 15 16
. _ _ 0,95 0,70 0,35 0,30 0,95 0,676
0,77 0,55 0,39 0,38 0,70 0,77
0,55 0,52 0,28 0,39 0,69 0,74
0,67 0,52 0,30 0,27 0,68 0,76
0,20 0,25 0,17 0,10 0,54 0,68
0,32 0,27 0,15 0,17 ' 0,42 0,65
0,28 0,33 0,21 0,21 0,80 0,67
0,48 0,33 0,25 0,17 0,85 0,75
_ _ _ 0,S6 0,71 0,43 0,48 0,85 0,71
0,94 0,77 0,54 0,72 0,87 0,71
0,83 0,64 0,40 0,42 0,76 0,71
0,11 0,17 0,10 0,07 0,35 0,66
0,53 0,43 0,28 0,21 0,59 0,70
0,21 0,29 0,17 0,13 0,54 0,70
0 37 0,64 0.20 0,16 0,60 0,69
_ _ _ 0,32 0,40 0,15 0T075 0,55 0.70
0,21 0,14 0,05 0,039 0,13 0,50
0,07 0,065 і 1,042 0,02 0,18 0,65
0,65 0,59 0,47 0,42 0,72 0,76
•*- 0.97 0,80 0.56 0,64 0,85 0,72


I 2 я 4 n Г) 1
Глюкокоротоксш ЄШІН нсо p-D-Глюкоза ■•h CH8 он
Гофр уз ид нсо P-D-Аллометилиза ■H CHg он
Пахигенин нсо ОН CH3 он
Секуригешін нсо ОН CHS он
Секурезид нсо P-D-Ксплоза CH3 он
Секурпдазид нсо P-D-Ксплоза + + a-L-глюкоза CH3 он
Узарпгонпн СИ3 ОН •■H CHs он
Узаригенпн-3-а-Ь~рам-

ноза

СНз ct-L-Рамноза •H CH3 он
Узаригепив-3-P-D- сн3 P-D-Глюкоза ••H CH. он
глюкоза
Хейрозид А СНз a-D-Глюкоза + + Р D-араби- ноза -H CH, он
Дцгитокснгеттп СН;) ОН H CH3 он
З-Эиидигитокс игенин сн3 •он H CH3 он
Г ИТОКСИГЄШШ СНз ОН H CH3 он
Дигоксигенин СНз ОН H CH3 он
Родекспн А СНз a-L-Рамноза H CH3 он
Аллизпд СНз a-L-Глюкомети-

лоза

OH CH3 он
Епшшдогснпн СП3 ОН OH CH3 он
Локундьеяид СІ І, a-L-Рамноза OH CH3 он
Дпштоксигенин-З-Р- СНз (j-D-Глюкоза H CH3 он
D глюкозид
Дигптоксин СН3 3 ДИГИТОКСОЗЫ H CH3 он
Г итоксигешга-3-P-D- СНз P-D- Глюкоза H CH3 он
ГЛЮКОЗИД
Строспезид СН3 P-D-Дшита-оза H CH3 он
Перпплоцпн СИ, i-D-Цимароза -f- -f- P-D-глюкоза OH CH3 он
Гитоксин СН3 3 ди~итоксозы H CHS он
Діігокси ген пн-3-oc-L- СНз Рамноза H chJ он
рамнозид
Дигоксш'еипн-3-P-D- СНз p-D-Кснлоза H CHs он
ксилозид
Дигок: пгеиин-3-P-D- СН p-D- Глюкоза H CH3 он
глюкозид
Дпгоксин СНз 3 ДИГИТОКСОЗЫ H CH3 он
Глюкодпфукозид ГН3 p-D-Фукоза -f- p~ D-глкжоз» H CHj он
Строфантидол СН2ОН OH OH CH, он
З-Эиистрофантидол СН30Н OH OH CH3 он

bgcolor=white>0,24
7 8 9 10 11 1,1 13 Г» 15 1Г,
___ ,-г-н ___ 0,47 0,43 0,28 0,21 0,69 0,67
___ 0,86 0,81 0,41 045 0,71 0,75
___ 0,97 0,80 0,57 0*67 0,70 0,76
___ 0,97 0,80 0 59 0,65 0,95 0,73
___ 0,75 0 62 0,40 О

ОС

00

0,82 0,76
0,21 0,23 0,14 0,09 0,45 0,64
_ _ «И» __ 0,95 0,80 0,60 0,70 0,90 0,76
0,96 0,74 0,48 0,45 0,84 0,77
0,95 0,70 0,35 0,30 0,95 0,76
0,64 0,22 0,14 0,13 0,43 0,61
_ _ 0,85 0,32 0,64 0,64 0,93 0,76
0,85 0,69 0,62 0,72 0,82 0,75
он 0,70 0,70 0,53 0,60 0 28 0,80
он 0,90 0 73 0,4 0,60 0,85 0,76
он 0.88 0,61 0 35 0,35 0,65 0,72
он 0,52 0,32 0,26 0,14 0,82 0,72
___ ___ он ___ 0,75 0,53 0,41 0,30 0,36 0,75
он 0 34 0,40 0,22 0,17 0,58 0,69
0,37 0,38 0,16 0,58 0,76
___ . ___ ___ _ 0,90 2,72 0,59 0,59 0,54 0,80
он 0,64 0,45 0,25 0,20 0,56 0,74
он ___ ___ _ . 0,88 0,67 0,47 0,54 0,89 0,75
0.70 0,34 0,23 0,16 0,65 0,67
он ___ 0,89 0,76 9,53 0,57 0,77 0,79
н он 0,89 0,61 0,3S 0,36 0,64 0,77
н он 0,60 0,50 0,36 0,29 0,70 0,77
н он 0,37 0,33 0,24 0,16 0,53 0,76
н он ___ _ 0,87 0,75 0,49 0,54 0,81 0,76
0,51 0,23 0,19 0,12 0,48 0,80
___ 0,90 0,73 0,48 0,53 0.79 0,71
0,77 0,52 0,36 0,30 0,80 0,73

bgcolor=white>З-О-Ацетатстрофаити-
1 2 3 4 >•
Строфаптид іл-l 9-a-L* рамноза СН,—О— —a- L- раміь)за он он СИ;, он
Строфаптидол-З-19-a- L-рамноза сн,-о-

—a L- рамиоза

осі,-Рамноза он сн3 он
Копваллятоксол СН2011 a-L-Рамноза он сн, Oil
ЭрИЗИМОЗОЛ сноп

2

p-D-Дцпггоксо- за + a-L-глю- ко а он СН3 он
ЭрпхрОоОл CII./JH P-D-Діігитоксо- за -f Р-D-ксилоза он СН; он
Гельветикозол сн2он p-D Днгптоксоза он сн, Oil
Дезглюкоэрикордин CILOH p-D-Гуломвтнлоза н сн, он
Эрикордип СН3ОН P-D-Гулометило- за + P-D-гліо- то.та н сн, он
Эвонолоиид сн.„бн a- L Рымноза н сн. он
Фругозид . СН3ОН P-D-А лломети.поза сн. он
Корогляуцигешш СН30Н oil •II :н3 он
Канпогенол СН/Ш ОН II сн3 он
Строфантин Г СН2ОН a-L-Рамноза он ill, он
17-Р-Н-Строфантиднн С1ІО ОН он сн3 он
17-р-Н-Конвалляток- сио a-L-Рамноза он сн3 он
СИН
Строфантидші-3-P-D- глюкозид (ацетат) ноо P-D-Глюкоза (ацетат) он сн3 он
З-О-Ацетатстрофантп- ноо сн3соо он сн, он
ДИН
СН2ОН снасоо он сн. он
дол
8-Ацетатконвалляток-

сол

СН,ОН a-L-Рамноза (ацетат) он сн. он
З-О-Ацетаткоротокси- нсо сн3соо сн3 он
генин
З-О-Ацетаткорогляу- СН..ОН снвсоо сн3 он
цигенин
* Системы растворителей при хроматографировании сердечных гликозидов форм — этанол (3 : і); 3 — бензол — этанол (3 : 1)1 4 — хлороформ уксусная (80 : 19 : 1), 6 —этанол. Величина фронта растворителя 20 см. Количество ье- ристой сурьмы в хлороформе.


Л

bgcolor=white>0,84
7 8 0 10 11 12 la l'i 15 16
0,53 0,64 0,26 0 15 0,63 0,74
0,13 0,36 0,10 0,03 0,28 0,55
0,47 0,40 0,14 0,18 0,53 0,72
0,25 0,21 0,11 0,07 0,58 0,63
0,44 0,38 0,20 0,18 0,60 0,72
0,82 0 62 0,35 0,38 0,75 0,76
___ 0,77 0,40 0,35 0,15 0,48 0,77
0,27 0,067 0,24 0,24 0,20 0,77
0,63 0,70 0,45 0,42 0,46 0,75
0,79 0,70 0,30 0.20 0,64 0,72
___ ___ 0,96 0,75 0,50 0,44 0,84 0,73
---- . 0,80 0,57 0,47 0,39 0,60 0,80
___ он он 0,040 0,040 0,10 0,04 0,29 0,59
___ ___ 0,84 0,69 0,47 0 55 0 87 0,76
0,80 0,63 0,46 0,54 0,80 0,78
0.93 0.80 0,61 0,74 0,97 0,77
0,93 0,81 0,58 0,71 0,95 0,76
0,92 0,S0 0,52 0,68 0,85 0,71
0,95 0,82 0,60 0,78' 0,80 0,71
0,97 0,82 0,67 0,86 0,75
О 0,90 0,82 0,64 0,71 0,72 0,80
в тонком слое силикагеля: 1 — бензол — бутанол (1:1), 50 % воды; 2хлоро- кислота — метанол (85 : 2 : 13); 5 — хлористый метил — метанол — формамид щестьа в наносимой пробе 20 мкг, Проявитель =■=■ насыщенный раствор треххло-


А5

Окраска пятен после обработка реактивом
Вещество 1-е направление С1 немедленно через 1 ч
2-е направление С2 види

мая

УФ види

мая

УФ
Дигитоксигер.тш 141 217 С С.З 3
Гитоксигенин 110 128 Ир жк ж ж
Дигоксигенин 90 122 с КрФ СЗ Б
Г игалоксцгснцн 143 205 Кр ж к ж ж
Дигятоксин 100 100 с с
Гцтоксин 75 59 КрК с СрС с
Дпгоксии 68 62 СрС СФ с Б
Гиталокспн 101 02 КрФ ж СЗ ж
Ацетилдигитоксип 132 105 с с
142 203 с С
Ацетплгитоксттн 104 139 СКр жк СрС ж
Ацетилдигоксин 117

100

147

138

СКр

СрФ

ж к

СФ

СрС

с

ж

Е

113 157 Срф СФ с Б
Дигиталин 6 2 КрК жк /КЗ ж
Дигитоаин 0 0
Ланатозид:

А

26 1S СрС СФ
В 16 12 КрК жк СрС ж
С 15 8 КрК КрФ СФ с
Строфа цтидшт
Строфантин К —■
Дсзацетиллаватозвд:

А

, , _ .... - ,.,
В -- ‘
С
Примечание, t. Системы растворителей при хроматографировании Г.2 — хлороформ — пиридин (6 : 1); СЗ — циклогексан — ацетон — уксусная кис : 0,t); С5 — бенаол — этанол (7:3); С6 — силуфол, бензол — этанол (4:01 С8 — бензол — этанол (3 ; 1), незакрепленный слой силикагеля с 43 % 50 %-й : 2 ; 2); СЮ — этилацетат — пиридин — вода (ВО : 10 ; 2,7); С11 — мегалэтил

: 66 : 14 : 2,2).

2. Двумерное хроматографирование (С1, С2> Rs отнесено к дигитоксину. 366 нм, Сокращения: С—синяя, 3 зеленая, Ф — фиолетовая, Б —Зелагх,,


сотрудником ВНИИХТЛС Е. И. Пучковой [75, 76). Изучена возможность применения ХТС для идентификации 72 карденолидов с применением 20 систем растворителей, из которых для идентификации предложено пять систем (табл. 18, 19). Минимальное количество открываемых гли- козидов и геиинов составляет 0,5—1 мкг. Обнаружение исследуемых веществ па хроматограммах проводили насыщенным раствором трех хлористой сурьмы в хлороформе.

пя силикагеле [302] bgcolor=white>
hRj в системах *
СЗ С4 С5 С0 С7 С8 С9 СЮ си С12
53 60 62 68 74 68
30 31 50 45 55 66 55
24 24 45 42 55 63 50
20 58 72 32 54 39 53 57 47
12 25 43 29 44 49 38
9 50 62 10 40
80 82 39 _ 58

43

_ _ _ _
42 52 17 10 10 22 20 13
___ 41 6 19 6 15 15 9
30 36 7 24
22

0

_ _ I 38 51 67 41
, 20 7 24 ___ ---- ,
4 13
10 27 2 11

карденолидов на силикагеле: С1 — этилацетат — метанол — вода (16 : 1 : 1); лота (05 : 33 : 2); С4 — хлороформ — метанол — дпхлорметан — вода (5:1:4: С7 — бензол — этанол (3 : 1), незакрепленный слой силикагеля с 25 % воды; уксусной кислоты; С9 — гексан — этилацетат — этанол — вода (15 : 75 : 10: кетон —*• вода (100 : 5,4J; С12 — толуол — этилацетат — пропанол— вода (20:


Реактив: анисовый альдегид — хлорная кислота. УФ-осветценве с длшюй волны Ср — серая, Кр — красная, Ж — желтая, К — коричневая.

Показано, что на хроматографическую подвижность сердечных гликозидов п их генинов оказывают влияние:

пространственное расположение гидроксильных групп при С-3 — генины с аксильныии гидроксилами имеют большее значение;

тип сочленения колец А/В — генины с транссочленением колец имеют R, больше, чем генины с циссочленением колец; количество и местоположение гидроксильных груші;


двойная связь в кольцах А/В;

характер заместителя при С10 п пространственное расположение лактонного кольца при С„.

Хромагографированием на тонком слое достигнуты хорошие результаты при идентификации сердечных гликозидов, при их количественном определении 1478], для доказательства в гликозидах различных примесей или продуктов разложения. ГГри этом используют две модификации хроматографии — в незакрепленном и закрепленном слоях носителя. При хроматографировании в незакрепленном слое силикагеля используют в основном следующие системы: бензол — этанол (3 : 1), насыщенную водой; бензол — этанол (7 : 3);. хлороформ — этанол (3 : 2); метилэтилкетон — толуол — вода — метанол — уксусная кислота (40 : 5 : 3 : : 2,5 : 1); хлороформ — уксусная кислота — метанол (85 : : 2:13); дихлорэтан — метанол — формамид (80 : 18 : 1); пентол — бензол — вода (1:1: 2).

Для разделения сердечных гликозидов Рейхелт и Питра [455] применили систему бензол — этанол (3 : 1), насыщенную водой. Использовали силикагель с определенным диаметром и Объемом пор, активной поверхностью, удельной массой п степенью активности. При этом были разделены: уабаии, конваллозид, копваллятоксин, адонитоксин, фру- гозид, гельветикозид, цимарин, нериолин, периплоцимарин, В монографии М. Шаршуновой с соавторами [302] приводится способ разделения 24 веществ на силикагеле путем двумерной хроматографии в системах, указанных в табл. 19.

После напесения веществ на пластинку хроматографируют в первом направлении, сушат и хроматографируют во втором направлении. Снова сушат при 90—100 °С и обнаруживают пятна смесью анисового альдегида п хлорной кислоты. Окрашивания, характерные для большинства исследуемых веществ, различаются при немедленном наблюдении и через 1 ч в ультрафиолетовом и видимом свете.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ФЛАВ0110ИД0В,

ПРОИЗВОДНЫХ КУМАРИНА II АНТРАХИНОНА

Кумарины, флавонопды и оксиантрахиноны являются типичными представителями соединений, имеющих в своих молекулах одноименные группы; С=0, —ОН, С=*С и С=»Н, а также основные фрагменты молекул, такие как а- и у-пи- роновый и хинопдный циклы. Наличие в молекулах указанных общих и специфических групп, а также в ряде слу-

чаев сахарных компонентов обусловливает проявление этими соединениями общих физико-химических свойств, а именно: слабо выраженных кислотных свойств, способности вступать в реакции комплексообразования, окисления, восстановления, присоединения, сочетания, замещения, люми- несцировать и поглощать при различных длинах волн.

Все перечисленные свойства положены в основу большинства методик анализа, которые приведены в обзорах, опубликованных нами ранее [71—75, 83]. В связи с этим в данной главе будет приведен лишь критический обзор методик анализа и показаны возможности применения комбинированных методик при решении различных задач формацев- тического анализа исследуемых классов соединений.

Оптические методы

Количественное определение исследуемых соединений в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотометрии или дифференциальной спектрофотометрии является одним из наиболее распространенных методов анализа всех трех групп исследуемых соединений. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы (для кумаринов в области 300—350 нм, для флавоноидов — 330—370 нм), так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2—5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0,5—1,0 % [19, 27, 207]. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о количестве кумаринов* флавоноидов и антрахинонов при их совместном присутствии.

Спектрофотометрические или фотометрические определения по реакции диазотпрования 1391 ] ранее были широко

распространены в анализе трех классов соединений. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с аптрахинонами, кумаринами, флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пнразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено не- специфпчностыо его и внутри каждого из классов соединений из-за прохождения реакции у флавонопдов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению К фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома, а у кумаринов — в случае отсутствия заместителей в положениях 3, 6 и 8. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинного содержания исследуемых веществ как в суммарных фотохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения оксикумаринов, антра- хинонов, флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотно-кислым галлием. Для получения окрашенного комплекса, устойчивого в течение 30 мин, для агли- конов необходим стократный, для гликозидов — дву- или трехкратный избыток реактивов [327]. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385—460 нм с хлористым алюминием, 385—500 нс с хлористым цирконилом, 400—455 нм с азотно-кислым галлием [29]. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотно-кислого галлия, позволяющая количественно определять 0,5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония — 0,9—1,0 ыкг и с хлористым алюминием — 1—2 мкг [26, 28, 29, 200, 201]. Описаны методики анализа флавонолов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм [393], а также с цинком [322] и мышьяком [326]. Получить истипное суммарное содержание антрахи- нонов, флавонопдов и кумаринов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у названных соединений одинакового количества комплексо- образующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные недостатки, метод нашел широкое применение при установлении суммарного содержания флавонопдов в сырье и суммарных фотохимических препаратах [194, 245]. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды,

Комплексообразующие свойства флавопондов положепы в основу и флуоромегрнческого метода [397, 413, 485, 501 ], являющегося на порядок более чувствительным, чем спект- рофотометрическпй, но не лишенного перечисленных недостатков последнего метода.

Широко распространена при определении общего количества флавонопдных соединений флавонов, флавонолов, халконов в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексообразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексообразования с солями металлов, и дает завышенные результаты [199], но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать пх для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как аглнконы, так и глн- козиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1—10 мкг/мл. В анализе антрахинонов метод применен во флуорометрическом варианте после восстановления образовавшегося комплекса дитионитом натрия [413]. Относительная ошибка определения ± 3,35 %. Для количественного анализа оксикумарниов метод не нашел практического применения.

Следующим методом определения флавонопдных соединений, антрахинонов н кумарпнов по оптической плотности является анализ продуктов взаимодействия названных соединений с 4-аминоантшшриновым реактивом. Анализ требует соблюдения ряда условий, как п при реакции диазотирования, и не является избирательным для каждого из классов исследуемых соединений и внутри классов 1391 ].

- В ряду спектрофотометрических методов анализа фла- ванонов наиболее чувствителен боргндрндпый метод (до 0,5—1 мкг/мл при длинах волн 535—500 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспропзводпости результатов [3911.

Пожалуй, самый чувствительный в анализе кумаринов, флавоноидов и антрахинонов флуорометрнческнй метод. Количественно оценить оксикумарини, флавоноиды и окси- антрахпноны этим методом возможно при наличии 0,05— 1 мкг вещества в 1 мл раствора Ц6, 81, 171—173, 236, 342, 361, 362]. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных вещссти в тканях растений [171, 173]. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохпми- ческях препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии.

Почти все колориметрические методы анализа антрахн- понов основаны на реакции Борптрегера [391]. Принцип се заключается в том, что окисленные формы антраценовых производных растворяются в щелочах, образуя красную окраску, а восстановленные — желтую. Реакция является положительной для антрахинонов хризацпнового ряда, т. е. для 1,8-диоксиантрахинонов 1355, 389, 391, ЗОЇ]. Антроны, антранолы, оксатропы, диантронил и их глпкозиды не дают красной окраски, по образуют ее после гидролиза и окисления. Поэтому в ходе определения полнота прохождения гидролиза является существенным фактором, влияющим на точность анализа. Прп этом следует учесіь легкость гидролиза гликозидов, в особенности биозидов глюкофрангулина, а последнего — до франгулаэмодина в водных растворах, что сказывается на воспроизводимости результатов. В то же время пекоторые виды лекарственного растительного сырья (алоэ и сенна) содержат производные, имеющие соединения с сахарным компонентом с помощью С—С связи. Из этих соединений сахарные компоненты количественно не отщепляются ни в кислотах, ни в щелочах. Так как проведение реакции Борптрегера предполагает полное расщепление эмо- динантрона до агликонов и последующее окисление до алоэ- эмодина, то применяются другие активные окислители, например, хлорное железо [391]. Таким образом, реакция Борптрегера не дает исчерпывающих сведений ни о содержании суммы всех антрахинонов, ни о количественном содержании каждого из антрахинонов в отдельности.

Использование щелочных реактивов, в частности гидроокиси натрия или калия, позволяет количественно оценить содержание халкопов со свободным положением 4 в присутствии флаванонов сиектрофотометрнческпм методом при Я = 400-450 нм [69, 78, 361 ],

Объемные методы

Количественное определение окспкумврипов, флавоно- ндов, антрахинонов в среде неводных растворителей ацетона, диметилформамида, диметплсульфоксида потенциометрическим методом возможно с использованием в качестве титрантов гидроокиси тетраэтиламмония или натрия. Метод имеет преимущество перед оптическими в точности определения и не требует наличия стандартных веществ для прове- депия количественной оценки [67, 131, 176, 188, 196, 239],

Малая чувствительность (для ппалпза требуется 0,0005— 0,001 г вещества) и недостаточная селективность для каждого из классов затрудняют определение без предварительного разделения веществ в сырье и суммарных препаратах [67], как и методика потенциометрического окислительно- восстановительного титрования, описанная для анализа производных аитрахнпона [185].

Достаточную избирательность по отношению к флавопо- идам имеет метод комплексонометрического титрования избытка ацетата свинца, не вступившего в реакцию осаждения с флавонолами, чго позволяет проводить определение последних в присутствии ацетилсалициловой кислоты, ант- рахиноиов, кумаринов [26].

Из объемных следует отметить метод окисления флаво- ноидов и оксикумаринов ферроциаиидом калия по /і-фенпл- антроиилопой кислоте. Однако метод длителен и не обладает избирательностью [104, 106],

Полярографические методы

Восстановление Кумаринов, аптрахипонов и флавоно- пд'ов на ртутном капельном электроде (РКЭ) положено в основу высокочувствительного полярографического метода их анализа. Метод позволяет анализировать сумму фла- воноидов, антрахнноиов, кумаринов в пересчете на одно из соединений каждого класса [231, 261], выбраннде в качестве стандарта. В отличие от спектрофотометрии окрашенных комплексов метод дает более близкие к истинному суммарному содержанию результаты для кумаринов [50, 252], флавоноидов [209], антрахнноиов [22].

Флавоноиды (флавонолы) могут быть определены на фоне 0,4 М раствора хлористого аммония при потенциале полуволны 1,5 В [24]. Осциллополярографическим методом на фоне буферных растворов калий хлорид — соляная кислота, калий гидрофосфат — натрий гпдрофосфат, лимонная кислота — едкий натр и лимонная кислота — соляная кислота проведен контроль содержания изосалипурпозида и суммы (±) — ііариіігеішп-5-гликозида в суммарном препарате фла- мин в присутствии флавонолов и их гликозидов [94]. Метод заслуживает внимания и особенно незаменим в научно-исследовательских разработках, так как позволяет устанавливать наличие внутримолекулярных связей [23], проводить идентификацию по величине потенциала полуволны [213], оценивать реакционную способность отдельных групп в молекуле 1210], В практике фармацевтического анализа и в особенности в заводских условиях полярографический анализ встречает затруднения, так как требует соблюдения строгих условий техники безопасности при работе со ртутью. К недостаткам метода можно отнести его малую избирательность (из-за близких величин потенциалов полуволн) по отношению к исследуемым классам соединении, в связи с чем требуется, как и при спектральных методах, предварительное разделение веществ.

Таким образом, из рассмотренных методик анализа ни одна не может быть применена для количественного определения каждого из исследуемых классов веществ в растительном сырье и суммарных препаратах без предварительного разделения. Этих недостатков лишены методы газожидкостной хроматографии и жидкостной хроматографии под давлением, позволяющие решать вопросы идентификации и количественной оценки веществ в микроконцентрациях. Однако при анализе окспкумарпнов и антрахинонов первый метод теряет свое преимущество из-за необходимости- переведения дапных соединений в метиловые эфиры пли три- метилснлильные производные, что усложняет и значительно увеличивает- время проведения анализа. Хроматография под давлением [324, 343, 449, 488, 499, 509] требует дорогостоящих и пока еще редких приборов, что на сегодняшний день не позволяет рекомендовать внедрять этот метод в практику фармацевтического анализа.

Комбинированные методы

В настоящее время широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюа- тах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определенном площади пятна па хроматограмме.

Комбинированные методы позволяют получить исчерпывающий ответ на вопрос о содержании каждого биологически активного вещества пли суммы веществ одного класса, устранив возможные ошибки, связанные с влиянием других групп или классов соединений, находящихся в сырье или лекарственных препаратах.

Решение вопроса анализа каждого из веществ или суммы веществ, относящихся к одному классу соединений, в ряду исследуемых соединений крайне необходимо, так как фда- вононды, антрахнионы и производные кумарина, исходя

пз путей бпоспнтеза, могут совместно присутствовать fi растительном сырье.

Из комбинированных методов количественного определения на нервом месте по числу публикаций стоит хромато- оптический метод. Он имеет несколько разновидностей, в именно: определение оптической плотности, или люминесценции, в элюатах пз пятен хроматограмм, сканирование оптической плотности, пли люминесценции, непосредственно па хроматограммах.

Для определения оптической плотности в элюатах из пятен хроматограмм применяют фотоколориметрическое, спектрофотометрическое и флуорометрическое определения. Инфракрасная спектрофотометрия применена в большинстве случаев лишь для качественных определений. Для повышения скорости анализа в последние годы получил распространение денснтометрический метод, позволяющий определить концентрацию вещества в пятне хроматограммы как фотоколориметрическим или спектрофотометрическим, так и флуорометрическим методом. Преимущество комбинированных методов анализа было оценено исследователями и нашло отражение в большом количестве публикаций [78, 137, 222, 225, 275, 366, 384, 500].

Так, анализ флавоноидных соединений в растительном сырье в настоящее время проводится в основном хроматооптическими методами. Оценивая фотометрическую методику определения флавоноидов с борной кислотой, В. Г. Минаева [144] показала, что методика неприменима для анализа растительного сырья, так как дает завышенные (до 40%) результаты. Поэтому установление содержания флавоноидов в сырье, на стадиях вегетации и в суммарном флавоноидном препарате, назвапном автором «буплерин», предложено проводить после хроматографического разделения на хроматографической бумаге марки «Ленинградская средняя С» в системе растворителей: уксусная кислота — муравьиная кислота — вода (10 : 2 : 3) в течение 40—45 ч. Проявляют хроматограмму 10%-м спиртовым раствором хлористого алюминия. Пятна элюируют с помощью 2-часового настаивания и последующего 30-минутного нагревания на кипящей водяной бане. Измерение оптической плотности проводят в элюатах при Хтах — 420 нм для глико- зидов и 430 нм — для аглпконов. В качестве стандартов для построения калибровочных кривых взяты кверцетин, пзорамнетин, рутин, изорамнетин-3-рутпнозид. Рабочие концентрации — от 3 до 7 мкг вещества в 1 мл раствора. Относительная ошибка определения 5—10 %, Описанным ме

тодом установлено содержание флавопопдов в 335 растениях флоры Западной Сибири [194].

Аналогично изучены динамика накопления робинина в астрагале [7]; содержание кверцетина в зверобое [265], гиперозида и рутина в листьях вахты [193]; определено время сбора различных видов володушки [271 ], десмодиума 1293]; накопление фелловппа в листьях бархата [214].

С применением двумерной хроматографии в системах растворителей 15%-я уксусная кислота и к-бутапол — вода — уксусная кислота (4:2:1), с последующим спектро- фотометрированием метанолышх элюатов пятен хроматограмм при 280 нм скутелярипа и при 315 нм байкаленна установлено содержание каждого из названных флавонои- дов в корнях, листьях и цветах шлемника Литвинова [178]*

С применением систем растворителей бензол — метанол — ацетон — ледяная уксусная кислота (70 : 20 : 5 : 5) и спектрофотометрированием продукта взаимодействия с диазотированной сульфаннловой кисло гой при 420 нм определено содержание рутина в готовых лекарственных формах [238]..

Хроматографическое разделение на бумаге в системе к-бутапол — уксусная кислота — вода (4 : 5 : 1) с последующим спектрофотометрированием диметнлформамидных элюатов из пятен хроматограмм при 366 нм 1189] или спиртовых алюатов с реактивом хлористого алюминия при 420 нм применено для количественной оценки гиперозида 1189] и мангеферина [161 ] в растительном сырье.

Содержание халкоигликознда бессмертника — изогелн- хризина в злюаіах из пятен хроматограмм установлено при 370 дм, а флавапогликозпдов (і) -нарингенин-5-глико- зида при 290 нм. Хроматографическая система—30% я Муравьиная кислота [225].

Применение хроматографии в тонких слоях сорбентов значительно сократило время анализа в основном за счет уменьшения времени хроматографирования (от 24—36 ч до 30—120 мин). Анализу, как и в случае хроматографии на бумаге, подвергались либо эганолыше злюагы хроматограмм, либо продукты взаимодействия с хлористым алюминием, борной кислотой. II. А. Тюкавкииой с соавторами [270] проанализировано содержание кверцетина и дигидро- кверцетина — преобладающих компонентов смеси флавоно- идов, выделенных из даурской лиственницы. Разделение осуществлено на тонком незакрепленном слое капронового порошка в системе этанол — хлороформ (35 : 65). Пятна элюировались смесью метанола и димегнлформамида (1 ; 1),

Оптическая плотность измерена после добавления к элюату раствора хлористого алюминия при длине волны для кверцетина 434 нм, а для дигидрокверцстпна — 315 нм. Без добавления хлористого алюминия оптическую плотность определяют при 351 и 315 нм соответственно для кверцетина и дигидрокверцетпна.

Применяя хроматографию в тонком слое целлюлозы,

W. Wildager, К. Herrmann [498] провели количественное определение флавонолов и флавонов в растительном сырье, используя систему растворителей хлороформ — муравьиная кислота — вода (50 : 45 : 5). Анализу подвергались экстракты из растительного сырья после гидролиза гликозидов до агликонов. При фотометрическом определении учитывался фактор пересчета для каждого из- гликозидов. Б. А. Кривут и соавторы [158] для анализа феллавина в листьях бархата Леваля также применили в качестве сорбента целлюлозу в системе 15%-й уксусной кислоты. Оптическая плотность этанольных элюатов пятен хроматограмм измерялась при 293 нм. Полиамидно-целлюлозные пластины при двумерной хроматографии с системами вода — этанол — метилэтилкетон — ацетилацетон (65 : 15 : 15 : 5) и уксусная кислота — этанол — вода (7 : 5 : 10) использованы R. Miller с соавторами [436] для установления накопления флавонопдов на стадиях вегетации. Спектрофотометри- рованию подвергались метаиольные элюаты при длинах волн 274 и 295 нм. Эти же длины волн использованы [478] при анализе флавонопдов в растительном материале после хроматографического разделения в тонком слое силикагеля Г с системой растворителей дихлорметан — уксусная кислота — вода (2:1:1).

Необходимо отметить, что п в количественном, и в качественном анализе наиболее распространен сорбент силикагель [70, 71, 205, 318, 362, 385, 501]. Так, W. Poethke [445] рекомендует применять для анализа комбинированного препарата, содержащего сок солодки и экстракт крушины, двумерную хроматографию на силикагеле с системами хлороформ — толуол — метилэтилкетон (40 : 40 : : 20) и хлороформ — метилэтилкетон — метанол (80 : 5 : 5), проводить измерение оптических плотностей пропнловых элюатов пятен хроматограмм ликвиритина при 374 нм, а изолпквиритина — при 278 нм. Для уменьшения затрат времени, связанных с элюацией веществ из пятен хроматограмм, находит применение денситометрический метод как в снектрофотометрическом [337, 372], так и флуорометри- ческом [277j 364j 377а 416] вариантах.

Суммарное определение антрахинонов в растительном сырье и экстрактах проводится на основе ранее разработанной реакции Борнтрегера с использованием методики Аутерхофа [391 ]. Но данной методике, принятой в большинстве фармакопей, гидролиз и экстракция агликонов выполняются в одну стадию кипячением сырья с ледяной уксусной кислотой. После добавления эфира и фильтрования производные антрахпнона извлекают 5%-м раствором едкого натра с добавлением 2%-го аммиака. Для окисления антронов и антранолов применяют перекись водорода при кипячении на водяной бане. Оптическую плотность растворов измеряют с использованием в качестве стандартов хлорида кобальта или 1,8-диокснанграхпнона [389]. Метод не показывает истинного содержания окисленных и восстановленных форм и, что пе менее важно, не поаволяег оценить наличие веществ, обусловливающих основной эффект действия гликозидов. Для решения этого вопроса рядом авторов предложено проводить определение составных частей экстрактов из антрахиноносных растений с применением хроматографического разделения на бумаге с последующим спектрофотометрированнем пли колориметрирова- нием формамидных пли метанольных элюатов из пятен хроматограмм [127, 409]. Системы растворителей приведены в табл. 2 п 3.

L. Horhammer с соавторами [380, 381 ] рекомендуют анализировать антрахиноны хроматоспектрофотометрическим методом с использованием в качестве сорбента кизиль- гель, системы растворителей этнлацетаг — метанол — вода (100 : 16,5 : 13,5) и измерением оптической плотности метанольных элюатов из пятен хроматограмм при 360 нм.

Сравнение методов определения алойна в соке после гидролиза по алоээмоднну и хромагоспектрофотометриче- ски показало лучшую воспроизводимость результатов при комбинированном методе [430]. При разработке метода анализа алойна в алоэ для включения в фармакопею ГДР взята та же длина волны (360 нм), но использована система хлороформ — этанол — вода (30 : 15 : 1), сорбент силикагель Г [485]. Метод определения сеннозидов листьев сенны и приготовленных пз нее экстрактов состоит в ХТС на силикагеле Г в системе «-пропанол — этилацетат — вода (4:4: : 3), элюировании формамидом и спектрофотометрпрованпп при 330 нм [239, 381 ].

Количественное определение и сезонные измерения содержания антрахинонов в ряде растений Египта проведено фотоколориметрпческим (>, — 500—510 нм) и хроматоспект-

рофотомотрнческпм методами после разделения двумерной хроматографией на силикагеле Г в системах бензол — метанол (8 : 2). Оптическую плотность элюата каждого пятна измеряли в 0,1 н. растворе едкого натра при длине волны максимума поглощения каждого окспантрахинона в диапазоне 496—520 нм [3661.

Разработана методика хроматоспектрофотометрического определения глюкофрапгулпна, франгулппа, эмодпиа п хри- зофановой кислоты в коре крушины ломкой и ее галеновых препаратах. Методика заключается в хроматографировании этанольпых элюатов на сплпкагеле в системе бензол — метанол (8 : 2) и фотометрированпи при длине волны 400 нм 0,1 н. элюатов из пятен хроматограмм. Содержание каж'дого из антрахннонов рассчитывали по калибровочному графику на фрапгулаэмоднн с учетом коэффициентов поправки для каждого из соединений. Методика позволяет оценить влияние лактона глюконовой кислоты как ингибитора глико- зидгпдролаз коры крушины на содержание глюкофрангу- лппа в лекарственных препаратах [61, 1271. Показано, что только с использованием хроматофотометрпческой методики определения можно оценить химически качество готовой продукции по основным биологическим активным соединениям — глюкофрангулпну и франгулину [611. К такому же заключению пришли венгерские авторы [3791, которые считают, что лишь спектрофотометрпческое определение глю- кофрангулина AfB в сырье после хроматографического разделения в тонком слое силикагеля позволит установить истинное содержание глпкозпдов, а метод Боритрегера в настоящее время следует отнести к устаревшим. Денсптомет- рпческая методика со спектрофотометрическим определением руберптриновой кислоты при 420 им и ализарина при 480 нм рекомендована для анализа этих антрахннонов в растительном сырье [470].

Высокой чувствительностью, позволяющей определять в пятне хроматограмм от 1 до 5 мкг сеннозидов, обладает денситофлуорометрпческип метод, основанный на разделении веществ на силикагеле Г в системе аммиак — этанол — пзопропанол — этплацетат (35 : 10:20 : 25) и переведении сеннозидов с помощью гидразина в флуоресцирующие соединения с максимумом флуоресценции при 555 нм. Относительная ошибка определения і 3,5 % [416]. Денситофлуо- рометрпческим методом предложено анализировать производные ІД-дпоксианТ'рона в экстрактах растений [408, 417] после хроматографического разделения в системе гексан — бензол — уксусная кислота (2:2: 1),

Хроматооптическио методы анализа кумпрппов в растительном сырье и фнгохимпчсскнх препаратах позволили, как и в случае флавоиопдов и аитрахипонов, устранить недостатки оптических методов и повысить селективность определений. Отличительной чертой этих методов является хроматографирование экстрактов на бумаге [2721 или в тонком слое [270, 281, 4021 без предварительной очистки с последующим установлением производных кумарина с диазореактивами [472, 2751 или непосредственным определением поглощения спиртовых элюатов из пятен хроматограмм при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения [272, 270, 2811 или флуоресценции [432, 435, 4471.

Чешскими [4011 и польскими [4091 исследователями предложены методики хроматоспектрофотометрического анализа антрахинонов на силикагеле Г с системой растворителей етилацетат — 85%-й этанол (10 : 3) или на пластинах «Силуфол» с системой бензол — ацетон — уксусная кислота (50 : 5 : 0,5). Данным методом определены фурокумарины в семенах аммп большой с использованием бумажно-хроматографического разделения 160 п системы п-гептан — бензол (4:1) или хроматографии в тонком слое силикагеля [4131, в системе бензол — этилацетат (9 : 1) при спектро- фотомстрировании в интервале 300=—315 нм; листьях фикуса [2731, сорбент —.окись алюминия в системе диэтиловый эфир и спектрофотометрировании при 298 нм. Содержание фурокумаринов семян пастернака [276] установлено после хроматографирования на кислой окиси алюминия в системах. петролейний эфир — диэтиловый эфир (2:1), а эску- летииа в цикории [2811 в. системе бензол — диэтиловый эфир (14 : 1). На этом же сорбенте в системе толуол — этил- ацетат — хлороформ — уксусная кислота (15 : 8 : 5 : 2) установлено содержание псоралена в семенах коронилы 12781.

Псорален и ангелицпп в препарате псорален [280] контролируется по собственному поглощению при длине волны 290 и 300 нм соответственно или с диазореактивом при 530 нм, система растворителей циклогексан — этилацетат (3:1).

Динамика накопления виснадина [205] в аммп зубной определена хроматоспектрофотометрнческим методом в элю- атах хроматограмм при 323 нм; система растворителей — чстыреххлорпстый углерод — ацетон (5 : 1). Также по собственному поглощению [473] или с применением молибде- новольфрамового реактива [378 J найдено содержание фурокумаринов в амми зубной после хроматографического разделения в тонком слое силикагеля Г, пропитанного форма- мидом в системе хлороформ — этанол (1:1) или бензол — хлороформ — ацетон (10 : 40 : 3).

Стабильность настоек, содержащих кумарини, установлена по содержанию указанных соединений с применением хроматографического разделения на силикагеле HF 254 в системе циклогексан — ацетон — изопропиловый спирт (16 : 2 : 1) и по спектрофотометрированшо элюатов при 203 им [359].

Количественное содержание во всех случаях хромато- оптических определений рассчитывают по калибровочным кривым, построенным с учетом потерь за счет неполной десорбции, или по удельным показателям поглощения с учетом поправочного коэффициента на сорбцию вещества сорбентом.

Из хроматоэлектрохпмических методов анализа производных а- и у-пиропа и антрахинопа описаны хроматополяро- графическпй метод анализа производных кумарина с применением хроматографии на бумаге [93, 211] ив тонком слое [228, 230] или с использованием пластин «Силуфол» [181 ]. Методики обладают высокой чувствительностью и избирательностью при относительной ошибке определения ± 5-7 %.

Подводя итоги обзора литературы по физико-химическим свойствам и методам анализа производных кумарина, фла- вона и антрахинопа, можно сделать вывод, что в настоящее время наиболее доступными и объективными методами контроля биологически активных соединений в растительном сырье и суммарных фитохимических препаратах являются комбинированные методы. Из комбинированных методов анализа наиболее доступными, чувствительными и быстрыми являются сочетания хроматографического разделения в тонких слоях сорбента с последующим оптическим определением в злюатах из пятен хроматограмм пли непосредственно в пятнах хроматограмм.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА КАРДЕНОЛПДОВ II БУФАДІІЕНОЛІІДОВ

Биологические методы

Сердечные гликозиды в связи с высокой биологической активностью требуют разработки наиболее точных методов количественной оценки. Существующие методы ана-

лйза, описанные в литературе, можно разделить па Две группы — биологические и физико-химические.

В основу биологического метода контроля положено токсическое действие сердечных глнкозидов на организм животного, в результате которого наступает систолическая остановка сердца. Биологические методы анализа основаны на определении биологической активности на кошках, лягушках, голубях и выражаются соответственно в кошачьих, лягушиных и голубиных единицах действия (КЕД, ЛЕД и ГЕД). Биологические методы имеют ряд существенных недостатков, а именно: они выражают только биологиче- - скую активность растений или препарата и лишь косвенно отражают количественное содержание отдельных гликози- дов в суммарных препаратах и растениях. Они достоверны, как правило, лишь в случае использования теплокровных животных, что приводит к удорожанию метода и необходимости организации специальной лаборатории. Кроме того, биологические методы все еще во многих случаях имеют слишком малую точность (от 10 до 25 %) [182]. Метод зависит от. времепи года, условий питания животного. Вследствие перечисленных недостатков необходимо, по-видимому, отдать предпочтение физико-химическим методам.

Физико-Х’имическпе методы

Титриметрпческий метод анализа сердечных гликози- дов основан на взаимодействии гликозпдов, содержащих при С-10 карбонильную группу с соляно-кислым гпдрокси- ламином [119] и уксусно-кислым гидроксиламином [120]. При взаимодействии соляно-кислого гидрокеиламина с карбонильной группой выделяется соляная кислота, которая связывается диэтиламином. Избыток же диэтиламина титруется раствором хлорной кислоты в метаноле. В случае же применения уксусно-кислого гидрокеиламина в ледяной уксуе- пой кислоте для альдегндсодержащих глнкозидов избыток реагента титруют потенциометрпчески раствором хлорной кислоты в уксусной кислоте. Метод объемного титрования для сердечных глнкозидов впервые применен Н. А. Казариновым и Н. П. Дзюбой [119, 120]. Примечательно в нем то, что он проводится по альдегидной группе, которая является также одним из носителей биологической активности гликозпдов.

Полярографический метод. В основу этого метода положена способность кардеполидов и буфадпенолпдов восстанавливаться па ртутно-капельном электроде. Для анализа гликозпдов этот метод впервые применен Хербургом с

сотрудниками [377], которые исследовали дпгитоксин, дигитоксигении, конваллятоксин, теветин и ланатозид. К). В. Шостеико и II. Я. Уралова [310] предложили полярографический метод количественного определения чистых сердечных гликозидов группы наперстянки и строфанта. Установлено, что па ртутно-капельном электроде восстанавливаются все указанные вещества при одном и том же потенциале. Это, очевидно, связано с тем, что восстановлению подвергается общая для всех веществ группировка атомов — ненасыщенное лактонное кольцо. Поведение карденолидов п буфадиенолидов на ртутно-капельном электроде в буферных растворах различно. Исследованиями Н. Е. Воробьева [55] показано, что карденолиды восстанавливаются в далекой отрицательной области, поэтому в качестве фона можно использовать четвертичные алкильные соли и основания. Буфадиенолиды восстанавливаются на фоне солей лития и четвертичных алкильных солей п оснований. Сделано предположение, что карденолиды п буфадиенолиды восстанавливаются по двойной связи, находящейся в сопряжении с карбонильной круппой. Это предположение сформулировано после сравнения полярографического метода с микрокулонометрическими измерениями. Полярографический метод был применен при определении корне- рина, строфантидина и корельборина П в препаратах и таблетках [51], а также при установлении глпкозидов в сырье, в частности, корельборина в корнях и корневищах морозника [52], а также при определении бовозида А'[53].

Спектрофотометрическне и колориметрические методы определения карденолидов. Известно, что сердечные глнкозпды группы карденолидов имеют интенсивную полосу поглощения в УФ-свете с максимумом при 218—220 нм, что обусловливается наличием а-ненасыщенного кольца в структуре молекулы [3, 301]. Величины молярного коэффициента поглощения карденолидов близки и находятся в области (1,5—1,6)-104. Работать при К = 218 нм в заводских условиях затруднительно, так как параметры водородной лампы спектрофотометров типа СФ не всегда позволяют проводить измерения прп длинах волн менее 220 нм. Сердечные же гликозиды группы буфадиенолидов способны поглощать ультрафиолетовый свет в области 300 нм. Эта область спектра более приемлема, следовательно, возможно спект рометрическое определен ие.

Колориметрические и спектрофотометрнческие методы определения кардиостерондов получили широкое распространение благодаря большой точности, чувствительности

и доступности аппаратуры. Эти методы основаны па получении цветных реакций сердечных гликозидов с различными хромоформпыми реагентами. В зависимости от того, по какой части молекулы гликозида проводят определение, методы анализа можно разделить на три группы: по лак- тонному кольцу; по стероидному скелету; по сахарному компоненту.

Сопоставление результатов, полученных тремя методами, позволяет установить не только количественное содержание, но и целостность молекулы.

Методы, основанные на реакциях с лактонным кольцом. Метод со щелочным раствором пикрата натрия. Основоположником реакции с пикратом натрия считают Джафса, который обнаружил, что креатин со щелочным раствором пикриновой кислоты образует красное окрашивание. В 1918 г. II. Baljet [319] применил эту реакцию для количественного определения гликозидов наперстянки. A. Knudson с сотрудниками [406], используя реакцию с пикратом натрия, пытались судить о биологическом действии препаратов дигиталиса, сравнивая их со строфантином К известной концентрации и известной биологической активности.

W. Neumann [440] установил постоянную зависимость между окраской и молярной концентрацией, используя электрофотометр для количественного определения растворов чистых гликозидов и для установления их по молекулярной массе.

Реакция Бальета многократно использовалась для анализа гликозидов наперстянки [90], желтушника левкой- ного [53], строфанта [320], ландыша майского [124, 248, 353]. В нашей стране реакция Бальета применялась для количественного определения суммы сердечных гликозидов в цветках ландыша и препаратах из этого растения, этот химический метод был сопоставлен с биологическим. В качестве стандарта использовался бихромат калия различной концентрации, соответствующей по интенсивности окраски определенному числу лягушачьих единиц действия, установленному по конваллятоксину [199] или по К-строфан- тину-|3 [249]. Недостатком этого метода является то, что при увеличении длины волны от 470 до 570 нм абсорбционная способность водного раствора бихромата калия падает значительно сильнее, чем у раствора сердечных глпкози- дов в случае их реакции с пикратом натрия. В. Г. Минаева [195] модифицировала метод Зильберг, заменив бихромат калия на азобензол, при определении суммы сердечных гликозидов в сирени стручковой.

В. Н. Коваленко [134—136] разработан метод анализа содержания сердечных глнкозпдоп в растительных образцах строфапта и горицвета, а также в препаратах путем двойного колорпметрировапия. Метод двойного колориметри- ровапия заключается в следующем. Вначале определяется оптическая плотность исследуемого раствора, состоящая пз суммы оптических плотностей гликозпдов и сопутствующих веществ. В другой пробе находится оптическая плотность исследуемого раствора после разрушения лактоштого кольца гликозидов. По разности полученных результатов вычисляется оптическая плотность, обусловленная сердечными глнкозидами. А. И. Ермаков [103] применил реакцию Бальета при разработке методики количественного определения суммы сердечных гликозпдов в траве желтушника серого. О. К. Спвнцкая для определения сердечных гликозидов настойки строфанта [247], настойки ландыша [248] также применила реакцию с пикрипопой кислотой. В качестве стандарта использовался сульфит натрия. Применение этого стандарта автор объясняет тем, что в образовании окрашенного соединения гликозидов и сульфита натрия лежит общий механизм. Сульфит натрия восстанавливает пикриновую кислоту -в пнкраминопую.

В объяснении механизма реакции с пикриновой кислотой ученые придерживаются различных взглядов. R. Wa- sicky [490] считает, что реакция Бальета обусловлена присутствием сахарного компонента. Однако позднее был высказан ряд предположений о том, что реакция протекает с участием активного атома водорода в а—р-лактонном кольце [405].

Из всех известных реакций именно реакции с пикриновой кислотой представляют наибольший интерес для количественного определения этой группы гликозидов. Однако со щелочным раствором пикриновой кислоты сходную реакцию дает большое количество веществ, которые также присутствуют в растении наряду с сердечными глнкозидами и имеют в своей структуре альдегидные, кетонные и другие функциональные группы. Они могут усиливать окраску испытуемых растворов перед колориметрнрованием, что относится к сахарам, сопровождающим гликознды в растениях. VV. Thomas и R. Dutcher [489] попользовали реакцию с пикратом натрия для определения восстанавливающих сахаров. По-видимому, в присутствии сахаров щелочной раствор пикриновой кислоты восстанавливается до пи- краминовой с появлением оранжевого окрашивания. Аскорбиновая кислота также дает подобное, окрашивание [103].

? В, П. Георгиевский, Н. Ф. Комиссареино, С. Е. Дмнтрун С5

А. И. Ермаков [103] выяснил влияние отдельных сахаров на изменение интенсивности окраски в условиях, при которых эта реакция протекает с лактонным кольцом глико- аида, и нашел, что природа реакции с альдегидо- и кетоса- харами иная, чем с гликозидами. Было установлено, что реакция свободных сахаров с пикратом натрия длится часами, а глпкозидов — 15—20 мин, поэтому сахара практически не мешают.

В работах F. Bell и J. Krants [325] показано, что оптическая плотность зависит от молекулярной массы гликози- дов, поэтому они рекомендуют пользоваться стандартами для каждого гликозида или в случае наличия одного гли- козида стандарта делать поправку на молекулярную массу определенного гликозида. Так как интенсивность окраски обратно пропорциональна молекулярной массе гликозида, то в качестве стандарта можно брать чистый строфантидин или другой достаточно чистый строфантовый гликозид. Для пересчета на отдельные гликозиды необходимо вводить факторы пересчета, которые представляют собой отношение молекулярной массы анализируемого гликозида к молекулярной массе гликозида, по которой строится калибровочный график. Максимум поглощения продукта реакции пикриновой кислоты с сердечными гликозидами, как указывает

Н. К. Абубакиров [4], лежит в области 490 нм, a A. Elba- nowska [345, 347] указывает максимум для конваллятокспна около 500 нм. Другими исследователями [502] доказано, что при спектрофотометрпческом определении сердечных глпкозидов более точные результаты получают при измерении в области 400—495 нм.

Нет единой точки зрения в вопросе отсчета времени с момента начала реакции до измерения оптической плотности. Ряд авторов считают, что определение необходимо начинать через 10—20 мин [253, 325], другие — через 30 мин [460], а третьи — более чем через 30 мин [134].

К. Boltze и R. Laufke [328] изучали условия проведения реакции с пикриновой кислотой: влияние растворителей, время наступления окраски, постоянство окраски — и установили, что измерение необходимо проводить через 15 мин, а для прохождения реакции необходимо брать 95 мл 1 %-го раствора пикриновой кислоты и 5 мл 10 %-го раствора едкого натра.

При применении пикриновой кислоты G. Brockelt [331] обнаружил, что концентрация реактива, этанола, а также применяемый светофильтр оказывают существенное влияние на интенсивность окраски, а следовательно, и на оптич^-

скую плотность. Окраска достигала своего максимума через 10 мин после смешения с реактивом и оставалась неизменной 90 мин.

Как указывает Н. К. Абубакиров [4], скорость реакции между пикратом натрия и гликозидами зависит от концентрации реагирующих масс и температуры, поэтому неправы те исследователи, которые рекомендуют проводить измерения по истечении 10 мин [254], 15 [241], 20 мин [136, 182) с момента смешения. Необходимо проводить измерения по достижении максимума оптической плотности [346, 355]. Максимальное значение оптической плотности растворов конвал- лятоксина остается постоянным до 20 мин для концентрации от 100 до 260 мкг и до 10 мин для концентрации от 324 до 524 мкг в 10 мл реактива. A. Elbanowska [346] установила, что для концентрации конваллятоксина 100 мкг в 10 мл реактива максимальное значение оптической плотности достигается через 15 мин с момента смешения реактивов и остается постоянным в точение 90 мин. Эти противоречивые результаты, вероятно, можно объяснить недостаточной чистотой конваллятоксина. В отношении времени отсчета реакции большое значение имеет замечание Н. К. Абубакирова [4], который считает, что в случае чистых гликозидов правильнее будет вести отсчет не через заранее предусмотренный отрезок времени, а по достижении максимума оптической плотности.

Чувствительность реакции с пикриновой кислотой 2 мкг. Как указывает G. Brockelt [331 ], при количественном определении с пикриновой кислотой, ж-динитробензолом .и 3,5- динитробензойной кислотой метод с пикриновой кислотой примерно вдвое чувствительнее, чем метод с последними.

Кроме пикриновой кислоты, для количественного определения применяют и другие нитропроизводные.

Метод со щелочным раствором 8,5-динитробензойной кислоты. Впервые D. L. Kedde [398], а затем другие авторы [464] применили щелочной раствор 3,5-динитробензойной кислоты для количественного определения гликозидов. Удельные показатели поглощения, время достижения максимума окраски и его постоянство зависят от природы растворителя, от концентрации 3,5-динитробензойной кислоты, от концентрации щелочи и от температуры. По методу Кедде сердечные глпкозиды можно определять в присутствии сахаров, органических кислот, что положительно отличает этот реактив от пикриновой кислоты. Метод с 3,5-динитробензойной кислотой был использован при определении сердечных гликозидов после хроматографического разделения [388].

Несмотря на некоторые преимущества перед пикратом натрия, реакция с 3,5-динитробензойной кислотой не является строго специфической и не нашла широкого применения.

Метод со щелочным раствором м-динитробензола. W. D. Raymond [452] определил уабаин в препарате и в растворе для инъекций. При этом было показано, что спиртовые растворы сердечных гликозидов после прибавления ж-дпнитробензола и щелочи окрашиваются в синий цвет. Т. Callback [335] модифицировал метод и применил его для оценки гликозидов строфанта и наперстянки. Метод Раймонда был полошен в основу количественного определения дигитокспна, вошедшего в Фармакопею США 14-го издания [320].

Прп применении л-динптробензола [343] показано, что большое влияние на окраску цветного комплекса оказывает концентрация отдельных компонентов. Концентрация этилового спирта может находиться между 50 и 70 %. Важно, прежде всего, точное соблюдение времени реакции. Окраска появилась тотчас после прибавления реактива и исчезла полностью в течение 8 мин. Чувствительность реакции 4—5 мкг. Некоторые авторы [334] рекомендуют начинать отсчет поглощения точно через 1 мин после прибавления раствора едкого натра из-за нестабильности окраски. Метод Раймонда применен для гликозидов и аглпконов после бумажно-хроматографического разделения [465].

Метод со щелочным раствором 2,4-динитродифенил- сулъфина. D. Н. Е. Tattje [486] исследовал целый ряд ароматических 2,4- и 3,4-динитросоединений, а также некоторые тринитросоединения, которые давали окрашенные комплексы с глпкозпдами наперстянки. Оказалось, что среди исследованных соединений высокой чувствительностью по отношению к карденолпдам обладает 2,4-дннптроднфенилсуль- фон, применяемый для количественного определения ди- гитоксина,

2, 4-Динитродифенилсульфон, довольно специфичный реактив на карденолиды, обладает высокой чувствительностью: молярный коэффициент поглощения карденолпдов с ним в 1,5 раза выше, чем с пикриновой кислотой, в 2 раза выше, чем с 3,5-динитробензойной кислотой [63, 64, 466]. Высокая чувствительность этого реактива позволяет работать с разбавленным раствором, что исключает необходимость в концентрировании растительного экстракта и очистке его от посторонних веществ и тем самым предупреждает потери гликозидов, Недостатком реактива является то} что максимум оптической плотности устойчив в точение t —1,5 МІНІ И SOI.

Метод со щелочным раствором 2,4,2' ,4'-тетрадифенила. В последнее время для обнаружения карденолидов наперстянки и гликозидов строфантидннового ряда предложена реакция с 2,4,2',4'-тетрадцфеішлом [СО, 448]. Этот реактив, несмотря на высокую чувствительность, не нашел широкого применения из-за трудностей, связанных с его синтезом, а также из-за малой устойчивости окрашенного комплекса во времени.

Комбинированные методы

Из литературных данных [497] известно, что биологический метод не дает представления о составе действующего комплекса гликозидов, получаемых из растительного сырья, В гликозидсодержащих растениях помимо сердечных гликозидов находятся и соединения других классов, которые могут реагировать с реактивами, применяемыми для количественной оценки гликозидов. Также мало удовлетворителен чисто химический метод, который позволяет оценить только сумму сердечных гликозидов. И лишь раздельное определение отдельных гликозидов дает возможность с достаточной точностью и надежностью оценить сырье и его препараты. Для идентификации средечных гликозидов в последнее время нашли применение методы хроматографии на колонках, бумаге и на тонком слое носителя.

Большое внимание при анализе гликозидов в растительном сырье, лекарственных формах заслуживает применение хроматографического разделения сердечных гликозидов с последующим колориметрическим определением их в индивидуальном виде,

Н. Erbring и Р, Patt [348], применив круговую хроматографию, разделили семь гликозидов ландыша майского. Для установления процентного содержания отдельных гликозидов в общей смеси был предложен денсптометрический метод [348],

A. Elbanowska [345] разработала хроматографический способ разделения па бумаге карденолидов ландыша (цветочная кисть, лист, цветоножка) для сырья и для получения из него галеновых препаратов. Хорошее разделение карденолидов достигнуто в двух системах нисходящим способом на бумаге Шлейхер-Шюль 2045 с применением подвижной фазы етилацетат — хлороформ — метиловый спирт — 0,9 %-й хлористый натрий (10: 5: 3,5; 1,5) и с применением подвижной фазы хлороформ — диоксан — бутиловый спирт — формямпд (70 : 20 : 5 : 5). 15 обоих случаях на хроматограммах получили по восемь пятен для сырья, по семь — для настойки, по шесть — для стабилизированного экстракта и по пять — для настоя.

Хорошее деление достигнуто при использовании бумаги ватман № 3 нисходящим способом в системе Питри: хлороформ—диоксап —бутиловый спирт — формамид (70: 20:5 : 5). Бумагу пропитывали в системе формамид — метанол (1 :4), при этом получено шесть пятен [345].

При количественном определении после бумажно-хроматографического разделения сердечных гликозидов, как правило, используют две параллельные хроматограммы. Первая — служит для обнаружения карденолидных пятен с помощью вышеназванных цветных реакций. Вторая — служит для определения пятен и элюирования их с дальнейшим количественным определением.

В процессе хроматографического разделения неизбежны потери (до 10% при элюировании) [331]. Величина этой потерн зависит от распределительных свойств бумаги. Но так как контрольную полосу подвергают бумажно-хроматографическому разделению и при этом получают воспроизводимые результаты, то потерями можно пренебречь.

J. Lutomski [423] с помощью хроматографии в тонком слое испытывал устойчивость гельветикозпда в различных формах (ампулах и драже). Хроматографирование проводили в системах: хлороформ — этанол (3:1) и ацетон —бензол (5:3). При оценке устойчивости К-строфантина-р в инъекционных растворах они применили систему хлороформ — этанол (3:2) [423]. Количественное определение проводили спектрофотометрически с 3,5-дшттробензойной кислотой.

Хроматография в тонком слое как аналитический метод представляет большой интерес не только для идентификации, разделения и определения чистоты препаратов, но и для количественного анализа. Сочетание этого метода с другими физико-химическими методами, например денситометрией, спектрофотометрией, флуорометрией, позволяет повысить эффективность фармацевтического анализа сложных многокомпонентных лекарственных смесей.

Количественное определение веществ после разделения с помощью хроматографии в тонком слое осуществляется двумя способами: непосредственно на хроматограммах и после элюирования с хроматограмм. По первому способу содержание веществ устанавливают по площади пятен [350, 471], измеренных планиметром, или алгебраически (вы

числяют по радиусам пятен) с последующим построением графиков зависимости площади пятна от количества нанесенного вещества, или же денситометрически [305]. Определение веществ непосредственно на хроматограмме возможно на пластинах со стандартным слоем сорбента.

Может быть широко использовано и определение веществ после элюирования с хроматограмм. При этом для количественной оценки используют методы объективной фотометрии, полярографии, неводного титрования и др. Однако следует учитывать, что данный способ может быть эффективно использован в том случае, если полностью извлекаются вещества из сорбента хроматограммы.

При количественном анализе разделение веществ на пластине можно локализовать с помощью так называемой направляющей хроматограммы [311]. При этом рядом с пятном анализируемой смеси наносят пятно эталонной смеси веществ. После разделения смеси закрывают анализируемую хроматограмму, а «направляющую» хроматограмму проявляют. На высоте пятен окрашенных эталонных веществ в хроматограмме отмечают соответствующие площади и после экстракции проводят количественное определение. Этот метод может быть использован в том случае, если качественный состав анализируемого раствора и эталонной смеси одинаков, поскольку находящиеся в исследуемом растворе сопутствующие вещества могут при определенных условиях значительно изменить значение Rf определяемых веществ.

Отдавая дань простоте и быстроте хроматографирования в тонком слое, следует подчеркнуть и возможность разделения большого количества веществ. Такое преимущество позволяет применить метод хроматографии в тонком слое в сочетании со спектро- или фотометрическими методами. Для этого необходимо подобрать условия, при которых вещество могло бы полностью десорбироваться. С этой целью J. Lu- tomski и др. [424] при разработке метода оценки устойчивости гельветикозида десорбировали вещества в пробирках, извлекая 3 раза смесью хлороформ — этанол (4:1). Эти же авторы при разработке хроматоколориметрического метода оценки стабильности конваллятокспна в различных фармацевтических препаратах извлекали анализируемые вещества тоже 3 раза, но уже смесью хлороформ — метанол (1:1).

Т. Bicari и др. [327] предложили пятна с веществами собирать количественно в центрифужные стаканы. После добавления смеси хлороформ — метанол (1:1) содержимое стакана перемешивали и центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 5000 об/мин, Отбирали аликвотную часть жид

кости нпд осадком и проводили спсктрофотометрирование.

Количественное определение гликозпдов после элюиро- вапня осуществляют при помощи различных реактивов: ксантгидроля [320, 502], 3,5-дннитробензойной кислоты [423], пикриновой кислоты [338], 2,4-динитродифепилсуль- фона, 2,4,2',4'-тетрапитродпфенпла (ТНДФ) [Об].

При разработке методик количественного определения сердечных гликозидов в растительном сырье основную роль играет подготовка раствора для хроматографирования. Это отбор средней пробы, экстрагирование и очистка экстракта.

Так как сердечные гликозпды могут находиться во всех частях растений [3], то длн их извлечения используют сухие, свежие, ферментированные листья, цветки и всю надземную часть растений. По данным А. II. Ермакова [103], в корнях ландыша 0,11 % сердечных гликозидов, в листьях 0,38%.

Из сырья глпкозиды чаще всего извлекают водой [345], 70%-м этиловом спиртом [68], метиловым спиртом [422, 490], 50%-м метиловым спиртом [345] пли же смесями: хлороформ — этапол (1 :1) [414], хлороформ — метанол (1 :1) 1411] н хлороформ — изопропиловый спирт (1:1) [414].

Дальнейшая обработка экстракта заключается в различных методах его очистки, в применении в основном растворителей, избирательно извлекающих либо гликозпды, либо сопутствующие вещества [407].

Сапонины п некоторые вещества фенольпого характера можно осадить из раствора как этиловым эфиром [422], так и добавлением основной соли свинца [101,4І4]. Установлено, что при этом основной акцепт свинца в процессе осаж- депия переходит в ацетат свинца. Избыток свинца удаляют с помощью сульфата натрия.

Возможно также относительное отделение сопутствующих веществ при использовании адсорбции гликозидов на угле [328]. Однако такой способ очистки не нашел широкого применения, так как при этом имеет место сильная адсорбция гликозидов.

Таким образом, из приведенного литературного обзора видно, что для анализа растительного сырья и суммарных очищенпых препаратов, содержащих кардеостероиды, как п для производных а- и у-пиропа, наиболее перспективны те методы, с помощью которых возможно идентифицировать и количественно определить все действующие вещества. Таким требованиям удовлетворяют только комбинированные методы, а именно: метод бумажной хроматографии и метод хроматографии в тонком слое с последующим спектрофото- метрпческим определением.

<< | >>

Еще по теме ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА КУ МАРИНОВ, ФЛАВОНОИДОВ, АНТРАХИНОНОВ И КАРДИОСТЕРОИДОВ и ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ АИТРАХИНОИА, КУМАРИНА И ФЛАВОНОИДОВ:

  1. ФЛАВОНОИДЫ
  2. РАЗДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЛАЗОПИРИДАЗИНА И САЛАЗОДИМЕТОКСИНА МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
  3. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ И ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ, СОДЕРЖАЩИЕ ФЛАВОНОИДЫ
  4. ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
  5. Методы анализа лекарственных средств
  6. ТОМ I. ОБЩИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
  7. Лекция № 24. СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ СРЕДСТВА: СУЛЬФАНИЛАМИДНЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ 8-ОКСИХИНОЛИНА, ПРОИЗВОДНЫЕ ХИНОЛОНА, ФТОРХИНОЛОНЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ НИТРОФУРАНА, ПРОИЗВОДНЫЕ ХИНОКСАЛИНА, ОКСАЗОЛИДИНОНЫ
  8. Основные параклинические методы, используемые в системе медицинского обследования спортсменов. Электрофизиологические методы
  9. Глава 3 Основные методы диагностики
  10. ГЛАВА 16. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ В ПРОФПАТОЛОГІЇ
  11. ГЛАВА 8. СТЕРИЛИЗАЦИЯ. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА
  12. Глава 11.УЛЬТРАЗВУКОВЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕОНАТОЛОГИИ
  13. Глава 46. Идентификация личности неопознанных трупов. 46.1. Общие положения
  14. Глава З МЕХАНОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
  15. Глава 1. Предмет, методы и объекты судебной медицины
  16. Глава 2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ВО ВРАЧЕБНОМ КОНТРОЛЕ
  17. ГЛАВА 16 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФИЗИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
  18. Глава 6 Методы общей диагностики заболеваний иммунной системы
  19. Традиційні методи контрацепції. Бар’єрні методи контрацепції