<<
>>

7.2. Методы определения скорости высвобождения

В настоящее время разработано и предложено много раз­личных методов по определению высвобождения лекарствен­ных веществ мазевыми основами. Все эти методы можно раз­делить:

— на модельные опыты in vitro, основанные на физико-хи­мических и микробиологических исследованиях;

— биологические методы in vivo, проводимые на живых организмах или изолированных органах.

Результаты биологических методов не всегда воспроизво­димы, поэтому для сравнительных исследований применяют опыты in vitro.

Для получения сравнимых результатов необходимо подде­рживать постоянную температуру, одинаковый состав опыт­ной среды, одинаковые концентрации лекарственного вещест­ва, использовать образцы аналогичной величины с одинаковой степенью дисперсности суспендированного или эмульгиро­ванного вещества.

Физико-химические и микробиологические методы

К этой группе методов следует отнести метод агаровых пластинок. Суть метода состоит в том, что небольшое ко­личество испытуемой мази наносят на агаровый гель, содер­жащий реактив, который образует окрашенные соединения с лекарственным веществом. По мере диффузии лекарственно­го вещества из мази окрашенная зона геля увеличивается. Ли­нейными размерами этой зоны и может быть измерена степень диффузии вещества из мази. Техника проведения метода упро­щается при использовании красителя в качестве диффундиру­ющего вещества. Если вещество способно флюоресцировать, то для его идентификации применяют аппарат для флюорес­центного анализа.

В том случае, если действующие вещества обладают анти­септическими или бактерицидными свойствами, применяют микробиологический тест, который отличается от предыду­щих методов способом идентификации. Определенное коли­чество мази вносят в цилиндрическое отверстие, сделанное в агаре, содержащим стандартную культуру микроорганизма. Микроорганизмы на питательной среде не растут там, где для них образуется минимальное тормозящее или губительное действие диффундирующего из мази вещества. Таким образом, вокруг мази образуется зона торможения, которая отсутствует при применении неподходящей мазевой основы. Диаметр или ширина зоны торможения, характеризующая степень диффу­зии лекарственного вещества из мазевой основы, измеряется через 24 или 48 ч инкубации чашек Петри с агаром в термоста­те (37°С). Время измерения зон зависит от скорости диффузии вещества.

Наиболее часто используются методы прямой диффузии, когда мазевая основа находится в непосредственном контакте со средой (раствором, гелем и др.), в которую должно диффун­дировать лекарственное вещество.

При применении хроматографического метода необхо­дима фильтровальная бумага, увлажненная раствором инди­катора. Мазь помещается в центре фильтровальной бумаги в небольшом цилиндре, открытом с обоих концов. Скорость диффузии определяется путем измерения расстояния от на­ружного края мази до наружного края окрашенной зоны на фильтровальной бумаге.

Сравнительно широко распространенным тестом для опре­деления высвобождения лекарственных веществ из мазей яв­ляется метод диффузии через мембра, когда изучаемая мазь отделяется от диффузионной среды какой- либо полупроница­емой мембраной.

В качестве мембраны используют пленки из натуральных или полимерных материалов различной природы (поливинилхлорид, пленки из ацетата целлюлозы, полиамида, целлофан и т.д.). Достаточно часто используют целлофан, так как толщина целлофановой пленки оказывает незначительное влияние на диффузию, а материал не вступает во взаимодейс­твие с лекарственными веществами.

Процесс исследования заключается в том, что определен­ное количество мази помещается в камеру для диализа, кото­рая погружается в физиологический раствор. Исследование проводится при температуре 37°С. Диффундированное ле­карственное вещество определяют обычными химическими или физико-химическими методами.

Чтобы приблизить условия опыта к условиям намазывания мази на кожу, используют устройство, в котором в процессе определения диффузии веществ, предусматривается пере­мешивание мази. Для приближения опыта к биологическим условиям применяют мембраны животного происхождения (например, переживающая кожа животных, яичная оболочка, слепая кишка ягненка, брюшина рогатого скота, кожа с затыл­ка кролика и другие) и соответствующую среду. В качестве среды, в которую диализирует лекарственное вещество, ис­пользуют воду очищенную, изотонический раствор хлорида натрия, раствор Рингера, буферные растворы и т.д.

В процессе разработки методик с микробиологической детекцией было предложено множество вариантов усовер­шенствований, которые можно объединить в три типа в соот­ветствии с тем, как вносится образец в культуру микроба, на­ходящегося в питательной среде.

Часто используемым методом является метод, при котором на полотне с культурой микроба (обычно пептоновый агар) делается небольшое круглое отверстие и заполняется пробой мази. Важно, чтобы образец находился в тесном контакте с питательной средой на всей поверхности отверстия, что на­дежнее достигается нанесением подогретого образца в полу­твердом состоянии. При сравнении результатов надо следить за тем, чтобы высота питательной среды в чашке Петри была одинаковой, среда имела всегда одинаковый pH, и не наблю­далось разницы в содержании других веществ, внесенных в питательную среду.

Другой возможностью усовершенствования опытов может быть размещение образца мази в металлическом (алюминие­вом) цилиндре на питательной среде.

Третья возможность — это нанесение образца на бумагу (диск в диаметре до 1 см), которая кладется на твердую пита­тельную среду.

Метод окрашенных комплексов предназначен для мазей с водо- и жирорастворимыми лекарственными препаратами на эмульсионных основах.

Для выбора оптимальной основы для мазей с водо- и жиро­растворимыми компонентами из числа имеющихся в распоря­жении эмульсионных систем используют метод окрашенных комплексов. 100 г каждой из выбираемых основ тщательно го­могенизируют с 5-10 кап. 2% водного раствора метиленового синего или 5-10 кап. 5% масляного раствора Судана III. Затем выявляют наиболее интенсивную окраску сравнением с этало­нами.

Эталонные растворы готовят методом стандартных серий. Исходными растворами для серий разведений служат 0,02% раствор метиленового синего в воде и 0,02% раствор Судана III в вазелиновом масле. Эталонные растворы помещают в оди­наковые стеклянные растворы с непрозрачной задней стенкой. Сравнение производят в отраженном свете. Шкала эталонных растворов представлена в таблице 4.

Таблица 4 — Шкала эталонных растворов
Индекс

эталона

Эталоны синих оттенков Индекс

эталона

Эталоны красных оттенков
основной раствор + вода в мл основной раствор + вазелиновое масло в мл
0,5 + 9,5 4,0 + 36,0
1,0+ 9,0 8,0 + 32,0
Зс 1,5+ 8,5 Зк 12,0 + 28,0
2,0 + 8,0 16,0 + 24,0
2,5 + 7,5 20,0 + 20,0
3,0 + 7,0 24,0 + 16,0
3,5 +6,5 28,0 + 12,0
4,0 + 6,0 32,0 + 8,0
4,5 + 5,5 36,0 + 4,0
Юс 5,0 + 5,0 10к 40,0 + 0,0

с - эталоны синих оттенков; к - эталоны красных оттенков


Рекомендации по выбору эмульсионных основ базируются на том, что для водорастворимых лекарственных препаратов целесообразно использование основ с более высоким индек­сом шкалы эталонов по метиленовому синему, а для жирорас­творимых - по Судану III [20].

Метод микроскопии предназначен для рационального вы­бора диспергирующих сред и основ для мазей - суспензий на липофильных основах. Метод позволяет сделать обоснованный выбор основообразующих и вспомогательных компонентов, а также их сочетаний. Кроме того, метод позволяет дать качес­твенную оценку готовым мазевым системам по доступности

нерастворимой фазы внешней гидрофильной среде. Первый этап приготовления проб мазей (в количестве 5,0 - 10,0, с со­держанием твердой фазы 5%) заключается в нанесении на по­верхность частиц первичного контактирующего слоя. В качес­тве последнего используют как сами основы, так и изучаемый сортимент вспомогательных компонентов. Нанесение контак­тирующих слоев проводят при растирании навески препарата в их среде. Затем вводится рассчитанное количество расплав­ленной основы, и смесь гомогенизируется до охлаждения. К приготовленной таким образом пробе добавляют равное коли­чество внешней гидрофильной среды - 0,1 % водного раствора метиленового синего. Проводят тщательное смешение, затем отбирают микропробы (6 микропроб по 3 мг каждая) После переноса их на предметное стекло и покрытия покровным пу­тем слабого давления, чтобы не нарушить систему, получают слои для просмотра. Просмотр ведется при увеличении 15 х 40 в 2 - 3 точках микропробы. Возможно образование 4-х ти­пов микроскопических полей: I - частицы окрашены и имеют голубую оболочку; II — частицы окрашены, но , не имея гид­рофильной оболочки, распределены в липофильной среде; III — частицы не окрашены, но имеют гидрофильную оболочку; IV - частицы не имеют окраски и гидрофильной оболочки и распределены в основе. Типы полученных микроскопических полей изображают схематично и делают вывод о рациональ­ном выборе вспомогательных веществ и основообразующих компонентов для каждого конкретного сочетания. Образова­ние типа IV свидетельствует, что использованное сочетание вспомогательного и основообразующего компонента не обес­печивает доступности данного препарата. Поэтому наиболь­шего эффекта следует ожидать от систем I, II, III, в которых водная фаза имеет доступ к частицам препарата [20, 21, 178, 179, 183].

Методы с химической (физико-химической) детекцией

При этих методах для оценки высвобождения лекарствен­ного вещества можно наблюдать или диффузию в жировой среде, или диффузию в водной среде в форме гидрогеля, или проникание в жидкую среду.

Диффузия в жировой среде (без перехода через полупро­ницаемую мембрану) может исследоваться следующим обра­зом: образец мази наносится на площадь, обозначенную на фильтровальной бумаге, которая кладется на раствор, пред­ставляющий рецепторную фазу. Закрытая чашка оставляется на 4 ч в термостате при температуре 25°С. Степень диффузии вещества определяется количественно в рецепторной фазе.

Другая разновидность этого же метода такова: образец на­носится на фильтровальную бумагу, помещается на дно чашки Петри, заливается, например, вазелином и оставляется на 12 ч при температуре 30°С. В вазелине определяется количество высвобожденного лекарства. Аналогичный подход существует и для веществ гидрофильного характера. В этом случае обра­зец заливается водой.

Если речь идет о гидрофобной мази, то ее можно исследо­вать прямой диффузией: мазь в растопленном виде наносится на водную рецепторную фазу.

Диффузия в водной среде. Техника диффузии в среде в форме гидрогеля аналогична технике опытов с микробиоло­гической индикацией на полотнах питательной среды. Гидро­гель выбирается по консистенции, преимущество отдается же­латиновым гидрогелям, а не агаровым. Нужно следить, чтобы образец мази имел очень тесный контакт с гелем, поскольку фазовая реакция должна быть выразительной, а граница цве­товой зоны - четкой. Недостатком этих методов является тот факт, что измерение диаметра окрашенной зоны сопряжено с довольно большой экспериментальной погрешностью. Вос­производимость результатов зависит от способа подготовки геля и полотна, от химического состава показателя детекции, от постоянства окраски образующегося соединения, продол­жительности выдержки и температуры.

Рецепторная фаза может быть водной (вода, физиологи­ческий раствор, раствор Рингера, буферные растворы) или безводной. Лекарственное вещество, которое в нее переходит, определяется химическими или физико-химическими, а в на­стоящее время, как правило, спектральными методами.

Приспособления для этих опытов просты и доступны [84, 178,197].

Наиболее распространенные из них схемы представлены на рисунках 30 и 31. Опыт проводится при температуре 37°С. Рецепторная фаза - раствор Рингера, мазь содержит красящее вещество, например метиленовый синий. Камера может быть снабжена мешалкой.

Рис. 30. - Устройство для исследования проникания лекарствен­ного вещества из мази в жидкую среду: А - трубочка с образцом мази; В-рецепторная фаза; С - целлофан.



Риє. 31. - Устройство для исследования проникания лекарствен­ного вещества из мази в жидкую среду: А - камера, заполненная образцом мази; В - рецепторная фаза; С - целлофан.


Методы оценки резорбции лекарственных веществ через кожу или слизистые оболочки

Исследование резорбции лекарственных веществ из мазей через кожу или слизистые оболочки проводят в опытах in vivo - на животных или на людях.

Проницаемость кожи по отношению к большому числу ак­тивных веществ изучалась многими авторами. На основе ре­зультатов исследований была разработана система опытов in vitro, позволяющая изучить факторы, управляющие процессом чрезкожной абсорции и транспорта лекарственных веществ [117, 141, 179,192].

Все методы, используемые в настоящее время для изучения резорбции через кожу или слизистые оболочки, подразделяют на три группы.

В первую группу входят методы обнаружения лекарствен­ных веществ, резорбированных через кожу, или их метаболи­тов в жидкостях и тканях организма.

Методы второй группы основаны на регистрации реакции организма на вводимое через кожу лекарственное вещество.

К третьей группе относятся методы, основанные на иссле­довании содержания количества активного ингредиента на месте аппликации мази.

С помощью методов, основанных на определении резорби­рованных через кожу лекарственных веществ или их метабо­литов, можно получить сведения не только о том, всасывается через кожу вещество или нет, но и о кинетике его резорбции. Однако многие вещества образуют в организме метаболиты, поэтому их определение в этом случае затруднено или практи­чески невыполнимо. С помощью разработанных современных методов физико-химического анализа возможно определять в динамике концентрацию лекарственного вещества, резорбиру- емого через кожу, или его метаболитов в крови, лимфе, моче, слюне, слезной жидкости, а также устанавливать распределе­ние вещества по тканям организма. С помощью метода плаз­менной фотометрии при использовании пламенного фотомет­ра ППФ - УНИИЗ и фотометра «Цейс» (Германия) многими авторами была определена кинетика резорбции ряда лекарс­твенных веществ через кожу из мазей [196].

Большие возможности в исследовании процессов резорб­ции лекарственных веществ через кожу и слизистые оболочки были получены с применением метода радиоактивных изото­пов. Об эффективности абсорбции вещества, скорости и пол­ноте его проникновения через кожу можно судить на основа­нии процента радиоактивности крови, мочи, слюны, лимфы, различных органов и тканей после аппликации известного количества меченого соединения, включенного в основу и на­несенного на кожу. Отрицательным моментом использования

радиоактивного метода является его дороговизна, применение только в специальных лабораториях, а также то, что многие ве­щества нельзя сделать мечеными, и не установлено полностью влияние меченых изотопов на проницаемость кожи [206,218].

В настоящее время широко используются гистологичес­кие исследования микросрезов кожи или слизистой, на основе которых устанавливают глубину проникновения изучаемого вещества из мазей. В этих методах применяют красящие или флюоресцирующие вещества. Эти методы являются менее чувствительными, чем гистохимические, так как на процесс всасывания химических веществ через кожу оказывают влия­ние ряд факторов, но главным из них являются физико-хими­ческие свойства самого вещества.

Для оценки резорбции веществ через кожу используют в качестве показателей изменения со стороны сердечно - сосу­дистой системы дыхания, рефлекторные реакции. Изучают ре­зорбцию лекарственного вещества по его фармакологическому эффекту, оценивая какую- либо специфическую реакцию орга­низма, отчетливо выраженную и хорошо изученную или ис­пользуя специальные фармакологические методики изучения определенного терапевтического действия лекарства. Методы, основанные на регистрации реакций организма на введение вещества через кожу, не могут дать точного представления о степени резорбции лекарственного вещества, механизме и путях его проникновения. В большинстве случаев эти методы позволяют установить лишь факт - проникает лекарственное вещество из мази через кожу или нет [173,174].

С помощью методов третьей группы можно оценивать ре­зорбцию лекарственных веществ по уменьшению их количес­тва на месте аппликации. Эти методы используются при ис­следовании резорбции лекарственных веществ через кожу из мазей на гидрофильных основах.

Используют и другие методы определения проницаемости кожи. Например, потенциометрический метод, основанный на определении сопротивления кожи при прохождении через нее тока до и после накожного применения мази.

Особую группу методов исследования активности мазей составляют методы оценки воздействия на экспериментально вызванные у животных экземы, дерматиты, ожоги и другие за­болевания.

Результаты проведенных исследований бйофармацевтичес- кой активности разрабатываемых мазей в опытах in vitro и in vivo должны обязательно являться основой для последующего изучения их в условиях клиник.

<< | >>
Источник: Лежнева Л.П., Никитина Н.В.. Мази - достижения и перспективы развития. Пятигорск: РИА-КМВ,2012.- 188 с.. 2012
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме 7.2. Методы определения скорости высвобождения:

  1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕАГИНОВ
  2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОДЫ МЕТОДОМ КАРЛА ФИШЕРА
  3. ВОДНЫЕ ПРОСТРАНСТВА И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СОСТАВА
  4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЛЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ФАКТОРОВ РИСКА
  5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАРЕ
  6. Определение биоэквивалентности и биодоступности лекарственных средств кинетическими методами
  7. Скорость циркуляции крови
  8. Лабораторные методы исследования витаминов. Определение аскорбиновой кислоты в моче по Тильмансу
  9. Размеры поражений и скорость их расширения в процессе наблюдения
  10. Методы определения причинно-следственных взаимосвязей факторов риска и здоровья населения, эффективности оздоровительных мероприятий
  11. СКОРОСТЬ И ВРЕМЯ У всякого мгновения своя вечность и свой закон.
  12. Мартиросов Э.Г.. Технологии и методы определения состава тела человека / Э.Г. Мартиросов, Д.В. Николаев, С.Г. Руднев. — М.: Наука,2006. — 248 c. — ISBN 5-02-035624-7 (в пер.)., 2006
  13. Определение здоровья. Основные методы его изучения. Группы здоровья
  14. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  15. Основные параклинические методы, используемые в системе медицинского обследования спортсменов. Электрофизиологические методы