<<
>>

АЛЬДЕГИДОКСИДАЗА

Альдегидоксидаза — цитозольный фермент по своей структуре напоминающий ксантиноксидазу—ксантиндегидрогеназу однако не являющийся альтернативой последней, так как не участвует в транспорте электронов в дегидрогеназно-оксидазном цикле. Альдегидоксидаза существует исключительно в окисленной форме, так что электроны получает от восстановленного субстрата (флавин). Попытка превратить фермент в дегидрогеназу, заменив молекулярный кислород на НАД+, не увенчались успехом.

Подобно ксантиоксидазе альдегидоксидаза в процессе каталитического акта генерирует активные формы кислорода, участвующие в реакциях с ацетальдегидом и образующие при этом соответствующие радикалы.

Экспрессируется альдегидоксидаза в различных органах и тканях животных и человека. Особенно высоки уровни активностей этого фермента в печени, легких и селезенке травоядных млекопитающих [221, 222]. В организме человека ее распространение несколько ограничено и включает, практически, только печень, а следовые количества наблюдаются в почках и сердечной мышце [220].

В настоящее время достигнуты значительные успехи в области препаративной энзимологии, позволившие очистить и выделить в гомогенном состоянии фермент кролика, морской свинки, бабуина и человека [225]. Его молекулярная организация и особенно структура активного центра была идентифицирована подбором многочисленных субстратов (хиназолины, фтала- зины) в качестве маркеров. Уровни активности фермента могут быть представлены следующим порядком: кролик < морская свинка < бабуин < человек. Эти и некоторые другие данные [226] свидетельствуют о том, что в этом плане, наиболее удачной моделью человеческой альдегидоксидазы могут быть ферменты морской свинки и особенно бабуина. Необходимо также отметить, что в организме собак этот фермент не зарегистрирован [226].

Несколько необычная форма фермента экспрессируется в нейтрофилах морских свинок, катализирующего окисление альдегидов и некоторых гетероциклических соединений, но не производных пурина [221].

Аналогично ксантиноксидазе, гормональный контроль альдегидоксидазы включает два направления. Одно из них зависит от андрогенов, приводящее к увеличению активности фермента, а другое — от эстрогенов, понижающее ее [201].

Несмотря на близость ксантиноксидазы и альдегидоксидазы по отношению к субстратам окисления (IX—XII) и идентичность механизма действия (раздел 8.1.3.1.1), в некоторых случаях ферменты отличаются позиционной избирательностью их действия. Так, альдегидоксидаза (АО) катализирует реакцию окисления пуринов в положении 8, а ксантиноксидаза (КО) — в положении 2 и 6. Образовавшийся в ксантиноксидазной реакции метаболит (6-оксипурин) может быть субстратом обоих ферментов. И, наконец, только 2,6-диоксипурин окисляется в положении 8 ксантиноксидазой до мочевой кислоты [217]:

Мочевая кислота, подобно другим производным пурина, существуют в лактим-лактамной таутомерной форме.

Лактимная форма мочевой кислоты является слабой кисло; той (pK'i = 4,5; рК'2= 10,3) и образует соли (одно- или двузаме- щенные натриевые или калиевые ураты).

Мы хотели бы обратить внимание еще на одну деталь, характеризующую взаимоотношение в живых организмах ксанти- оксидазы и альдегидоксидазы.

В опытах in vitro оба фермента взаимодействуют с гипоксантином с различными константами связывания, образуя при этом ксантин. Известно и то, что в процессе распада нуклеиновых кислот или нуклеозидов образуются в большей степени гипоксантин и гуанин, которые только ксантиоксидазой окисляются до мочевой кислоты. Аль- дегидоксидаза практически инертна по отношению к эндогенным пуринам. В случае ксантинурии (наследственное заболевание, связанное с дефицитом ксантиноксидазы) в моче пациентов обнаруживается не гипоксантин, а ксантин [221]. Следовательно, действие альдегидоксидазы реализуется только в критических (патологических) ситуациях. Об этом свидетельствует еще один факт [217, 227]. Если экспериментальным животным вводить ингибитор ксантиноксидазы аллопуринол, то в их моче присутствует весьма необычный метаболит пуринов 6,8-диоксипурин.

Пуриновые нуклеозиды с очень малой скоростью окисляются молибдензависимыми оксидазами [221]. По-видимому, для окисления азотистого основания необходимым является гидролиз Р-гликозидной связи нуклеозида.

Катионы N-гетероциклических соединений — вторая группа субстратов молибдензависимых оксидаз и особенно альдегидоксидазы. Положительный заряд препятствует реакции электрофильных агентов с гетероатомом и сильно дезактивирует углеродные атомы кольца. Поэтому облегчается атака нуклеофильных агентов в а- или некоторые другие положения по отношению к гетероатому.

Для гетероциклических катионов отмечено [217] уменьшение значения Кт (альдегидоксидаза) при повышении pH среды. Для альдегидов и незаряженных гетероциклических соединений наблюдается обратная закономерность. Ксантиноксидаза практически не катализирует окисление катионов пиридиния даже при pH выше 9,3.

Для Ы‘-метилникотинамида обнаружены [221] два альтернативных пути его окисления альдегидоксидазой:

Описаны [228] некоторые закономерности ксантиноксидаз- ного и альдегидоксидазного катализа альдегидов. В целом их можно свести к следующим пунктам. Во-первых, оба фермента значительно уступают другим, например, альдегиддегидрогена- зе по активности. По-видимому, в организме они не играют большого значения в реакциях окисления альдегидов. Во-вторых, в отличие от альдегиддегидрогеназы альдегидоксидаза окисляет тогда субстраты с оптимальной скоростью, когда в их алифатическом скелете содержится три углеродных атома. При наличии шести углеродных атомов и более альдегидоксидаза практически не взаимодействует с такими субстратами. В-третьих, ксантиноксидаза, за небольшим исключением, практически не окисляет эндогенные альдегиды [229].

Ароматические альдегиды (бензальдегид) являются более специфичными субстратами для альдегидоксидазы, чем для альдегиддегидрогеназы [217]. Однако если в одной молекуле содержится фрагмент гетероциклического кольца и ароматического альдегида (хинолин-6-альдегид), то альдегидоксидаза на первом этапе окисляет только а-углеродный атом, а затем альдегидный фрагмент [150]:

В заключение отметим одну необычную реакцию, катализируемую альдегидоксидазой. Установлено [222], что этот фермент может осуществлять процесс дегидрирования ксенобиотиков, т. е. обладать свойствами дегидрогеназы. В качестве субстрата использован в этом случае хлорид-3-метилхиназо- лин-2-он:

Для ксантиноксидазы аналогичной реакции не обнаружено.

Специфичного субстрата альдегидоксидазы к настоящему времени не существует. Поэтому с целью идентификации и особенно определения активности в присутствии ксантиноксидазы используют ингибиторы. Так, менадион ингибирует окисление аллопу- ринола, а гидралазин карбазерана. Метадон также используется в качестве ингибитора (Кі= 10-7м) альдегидоксидазной реакции [230]. Интересным является тот факт, что SKF-525 А, ингибитор широкого спектра действия семейства CYP450, замедляет скорость реакции окисления карбоксамида акридина с участием альдегидоксидазы [231].

В заключение отметим, что молибдензависимые ферменты принимают участие в реакциях восстановления (раздел 8.8.2) ряда ксенобиотиков [217, 221]. Среди наиболее распространенных реакций восстановления, катализируемых этими ферментами следует назвать трансформацию гидроксамовых кислот до амидов, эпоксидов до олефинов, сульфоксидов (сулиндак) до активных сульфидов.

Помимо активации субстрата и переноса электронов и протонов возможно участие молибдена в поддержании нативной структуры фермента. В свою очередь, белковая часть фермента может участвовать в поддержании каталитической активности свободнорадикальной формы молибдена.

8.1.4. ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

В предыдущих разделах указывалось, что реакции, включающие перенос электронов, называются окислительно-восстановительными (Fe^ ■ Fe3+). Характер реакций между ковалентными соединениями привлекает понятие электроотрицательности и различной степени поделенности электронов. На примере любой реакции, катализируемой цитохром Р450-зави- симыми ферментами происходит замена связи С—Н на связь С—ОН. Поскольку кислород более отрицателен, чем водород, он оттягивает электроны от атома углерода. Дипольный момент ксенобиотика характеризует величину смещения электронов от атома углерода, подвергшегося окислению, к атому кислорода, который восстановился, хотя при этом оба атома всего лишь «поделили» электронную пару.

В некоторых других случаях органические вещества окисляются по существу отнятием водорода, т. е. дегидрированием. Например, окисление гидрохинона можно представить следующим образом:

Эту реакцию можно также рассмотреть по стадиям, первая из которых является кислотной диссоциацией, а вторая сводится к потере электронов:

Если бы окислителем был ион трехвалентного железа, суммарную реакцию можно было бы записать следующим образом:

align=left>

ОН

он о

В приведенном примере протоны и электроны независимо отделяются от окисляемой молекулы.

Одним из примеров наиболее универсальных реакций биологического окисления является дегидрирование спирта до кетона или альдегида.

Известно, что два удаляемых атома водорода перемещаются на водород-переносящие коферменты (НАД, НАДФ, ФАД и ФМН). При восстановлении НАД только один из атомов водорода, удаляемых из молекулы спирта, связывается с НАД, превращая его в НАДН, тогда как другой становится свободным протоном:

НАД+ + 2Н+ — НАДН + Н+.

Исследование дейтерированных спиртов и их окисление под действием НАД показало, что дегидрогеназы катализируют прямой перенос к НАД+ водорода, который связан с углеродом спиртовой группы. В то же время водород, присоединенный к кислороду спирта, освобождается в среду в виде Н+.

Упомянутые выше наблюдения дают основание рассматривать эти акты биологического окисления (дегидрирования) как удаление гидрид-иона Н“ совместно с протоном Н+, а не как

удаление двух атомов водорода. Таким образом, НАД+ и НАДФ+ обычно рассматривают как коферменты, акцептирующие гидрид-ион. Не вдаваясь в детали истинного механизма реакции дегидрирования, удобно классифицировать большинство актов метаболического переноса водорода с позиции переноса гипотетического гидрид-иона. Эту частицу можно считать нуклеофилом, который может отщепляться от субстратов (дегидрирование) или присоединять к двойным связям (восстановление, раздел 8.2). Следовательно, дегидрогеназы могут осуществлять реакции в прямом и противоположном направлениях.

Отличает дегидрогеназы от монооксигеназ то, что первые никогда в качестве акцептора электронов не используют кислород и локализуются в большинстве случаев в растворимой фракции клеток, т. е. не являются мембраносвязанными. Исключением может быть ксантиноксидаза, которая в определенных условиях переходит в ксантиндегидрогеназу (раздел 8.1.3.1). Для альдегидоксидазы такая манипуляция не возможна (раздел 8.1.3.2).

Среди других представителей этой группы ферментов наиболее изученными и интересными с точки зрения окисления лекарственных средств являются алкогольдегидрогеназа (ADH) и альдегиддегидрогеназа (ALDH).

Интерес к ADH обусловлен также и тем, что она играет определенную роль в промежуточном обмене в организме этилового спирта, который образуется в клетке естественным путем либо может быть внесен туда извне. Отсюда, ADH — объект пристального внимания исследователей в связи с социальным заказом, обусловленным алкоголизмом. Несмотря на то, что согласно современным представлениям алкогольная мотивация [232] по своим генетическим и нейробиологическим механизмам является независимым феноменом от других проявлений, например, фармакокинетики и метаболизма этанола [233] все же активность ADH вносит свой вклад и в эти процессы. Фермент широко представлен в животных тканях: печени, почках, мышце сердца, слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта [234]. В печени присутствуют две различные субъединицы ADH, каждая из которых содержит два Zn2+, одни из которых стабилизирует третичную структуру фермента. Это достигается благодаря связям с лигандами сульфгидрильных групп остатков цистеина в положениях 97, 100, 103 и 111 молекулы. Другой атом цинка связан с сульфгидрильными группами цистеиновых остатков в положениях 46 и 174 и с имидазольной группой гистидина 67. Присоединение НАД+ к ферменту происходит таким образом, что возможен перенос гидрид-иона.

Две различные субъединицы ADH дают начало электрофо- ретически различным изоформам. В тканях крыс выделено три изофермента. В печени содержатся ADH-2 и ADH-З, имеющие относительно групповую субстратную специфичность [235]. Так ADH-2 имеет высокую активность к спиртам и альдегидам с короткими, средними и длинными алифатическими цепочками. В то же время ADH-З с довольно высокими скоростями дегидрирует спирты со средними и длинными алифатическими цепочками и является не активным по отношению к этанолу. Данная изоформа весьма эффективна в реакциях восстановления 3-кетостероидов и ретиналя до соответствующих ЗР-окси- стероидов и ретинола.

Для ADH характерной особенностью является половой диморфизм, зависящий во многих случаях от содержания в организме тестостерона. Экспериментальным путем показано [236], что активность печеночной ADH самок крыс значительно превышает этот показатель у самцов. Для ALDH такая закономерность не отмечена.

Отметим также, что окисление этанола ADH до ацетальдегида не единственный путь, имеющий место в клетке. Существует так называемая микросомная этанолокисляющая система (МЭОС), характеризующаяся [237] широкой субстратной специфичностью, так как участвует в метаболизме этанола, метанола, пропанола, бутанола и пентанола. Путем реконструкции МЭОС установлено, что данный ферментный комплекс содержит CYP450, НАДФН-цитохром с редуктазу и фосфолипиды (раздел 8.1.1.1). Каталаза (раздел 8.1.1.3) в перокси- дазных реакциях участвует в окислении метанола, этанола и других спиртов. Скорость реакции зависит от скорости образования пероксида водорода, концентрации каталазы и спирта. Фермент с одинаковыми скоростями окисляет метанол и этанол, в отличие от ADH, и активность каталазы уменьшается когда субстратами служат высшие спирты.

Многие циклические спирты ферментативным путем дегидрируются до соответствующих кетонов. В частности, 3-оксигек- собарбиталдегидрогеназа катализирует окисление 3-оксигексо- барбитала до 3-оксоаналога. Фермент, выделенный и очищенный из растворимой фракции морской свинки значительно отличается по своим свойствам от аналогичного фермента, изолированного из печени кролика [238]. Это прежде всего касается субстратной специфичности. Оптимум pH НАД-зависимой формы фермента составляет 8,7, а НАДФ-зависимой — 8,9.

Аценафтен-1-ол в организме экспериментальных животных превращается в кетон, находящийся в таутомерном равновесии с 1-оксиаценафтеленом. В реакции с дегидрогеназой, катализирующей данный процесс, в качестве кофактора используется НАДФ [239]. В то же время окисление цис- и транс-аценафтен- 1,2-диолов до соответствующего нафтахинона осуществляется микросомной дегидрогеназой, использующей НАД в качестве акцептора гидрид-иона.

Вторичные спирты подвергаются процессам дегидрирования в микросомах и растворимой фракции гепатоцитов. Это касается прежде всего 5-бром-2-аминобензгидрола, использованного нами в качестве субстрата соответствующего фермента [240]. Продуктом реакции был 5-бром-2-аминобензофенон, по концентрации которого типировалась реакция дегидрирования. Было отмечено, что в микросомах гепатоцитов крыс процесс протекает интенсивнее. Однако при увеличении в инкубационной среде субстрата до 300 ммоль количество образовавшегося продукта реакции достоверно снижается в микросомах и увеличивается

в растворимой фракции. Замена НАД на НАДФ приводит к уменьшению количества образовавшегося продукта в микросо- мах к увеличению его в растворимой фракции. Следует отметить, что в общем, ферменты дегидрирующие циклические спирты, по многим свойствам напоминают 30- и 110-оксистеро- иддегидрогеназы [241].

Независимо друг от друга, нами [242] и венгерскими учеными [243] был обнаружен необычный процесс дегидрирования, затрагивающий гетероциклическое кольцо тетрагидро-1,4-бенз- диазепинов. В частности, мы в своих исследованиях использовали следующий субстрат и продукт реакции дегидрирования:

Такой тип превращения вещества широко распространен в организме и обнаруживается в печени, почках и надпочечниках крыс, морских свинок и мышей [242]. В постмитохондриальной фракции гепатоцитов и клеток надпочечников дегидрогеназная активность увеличивалась в ряду крысы > мыши > морские свинки. В клетках почек дегидрирование субстрата в организме мышей и морских свинок примерно одинаково и несколько выше, чем в организме крыс. Следует также отметить, что изучаемый субстрат претерпевает процесс дегидрирования и в микросомной фракции. Оказалось, что скорость восстановления НАД в инкубационной среде с субстратом и микросомами гепатоцитов и клеток почек выше у морских свинок, чем у мышей. Скорость дегидрирования субстрата растворимой фракцией (после осаждения микросом) клеток печени мышей и морских свинок почти одинаковы, но несколько выше, чем у крыс. Активность фермента в растворимой фракции клеток почек

морских свинок и мышей выше, чем у крыс. Микросомы и растворимая фракция надпочечников исследуемых органов с одинаковой скоростью дегидрируют субстрат, и процесс не зависит от вида экспериментальных животных.

Следовательно, по своей локализации ферменты, катализирующие дегидрирование тетрагидро-1,4-бензиазепина отличаются от других дегидрогеназ (раздел 8.3.1.1). В частности, активность

3- оксигексобарбиталдегидрогеназы равномерно распределена в постмитохондриальных фракциях клеток печени, почек и надпочечников [238]. Но в гепатоцитах морских свинок и мышей она в два-три раза выше, чем в почках и надпочечниках.

Увеличение концентрации ионов водорода приводит к резкому снижению процесса дегидрирования тетрагидро-1,4-бенз- диазепина. Оптимальная активность достигается при pH 9 в обеих фракциях гепатоцитов морских свинок [244]. Максимальное действие 3-оксигексобарбиталдегидрогеназы, по данным [238], наблюдается при pH 8,7 (НАД-зависимая форма) и 8,9 (НАДФ-зависимая).

Внесение в инкубационную среду алкогольдегидрогеназы, в случае микросом и растворимой фракции, не влияло на скорость дегидрирования.

Полученные результаты свидетельствуют об особенностях ферментов, катализирующих дегидрирование тетрагидро-1,4-бенз- диазепинов, и их отличительных свойствах от других дегидрогеназ.

Физико-химические свойства тетрагидро- 1,4-бенздиазепи- нов и их субстратная принадлежность к дегидрогеназам, во многом определяет их дальнейшую метаболическую модификацию [245, 246] и фармакокинетику [247].

Дальнейшее окисление альдегидов, на ряду с ксантинокси- дазой (раздел 8.1.3.1) и альдегидоксидазой (раздел 8.1.3.2) осуществляет ALDH [248]. Одна из изоформ (НАД-зависимая), этого фермента локализована в митохондриях и растворимой фракции клеток животных. В растворимой фракции фермент представлен двумя формами, отличающимися друг от друга субстратной специфичностью. Наиболее изучена ALDH печени лошади. Выделенный в чистом виде фермент обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует окисление алифатических альдегидов (пропиональдегида, 2-хлорацетатальде- гида, глицеральдегида, финилацетальдегида). Ароматические альдегиды (бензальдегид, о-нитробензальдегид и фурфураль- дегид) не взаимодействуют с указанным ферментом.

8.2.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004

Еще по теме АЛЬДЕГИДОКСИДАЗА:

  1. ВОССТАНОВЛЕНИЕ
  2. 8.1.3. МОЛИБДЕНСОДЕРЖАЩИЕ ФЕРМЕНТЫ
  3. ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ
  4. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
  5. Витамин В2 (рибофлавин)
  6. РЕАКЦИИ И МЕХАНИЗМЫ КАТАЛИЗА
  7. Юрий Андреевич Андреев. Три кита здоровья СПб.:,1994. — 382 с., 1994
  8. Предисловие к 14-му официальному изданию (неофициальных, воровских было без счету)
  9. Предисловие к 11-му изданию
  10. Предисловие к 7-му изданию