<<
>>

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

Большинство генов эукариот, в отличии от генов прокариот имеют прерывистую структуру. Относительно короткие кодирующие участки (экзоны) чередуются с некодирующими участками (интроны). Регуляторные элементы гена — промоторы, определяющие точность инициации, транскрипции, локализованы перед первым экзоном на 5'-конце нити ДНК и представлены несколькими элементами (ТАТА-, ССААТ-боксы, GC-мотив). Экспрессия генов регулируется также усилителями (энхансеры), ослабителями (сайленсоры), а также инсуляторами (ограничители действия энхансеров) и элементами отклика, взаимодействующими с факторами транскрипции, ксенобиотиками, стероидными гормонами и др.

Эти последовательности участвуют в определении частоты инициации транскрипции [448, 625].

Первый этап реализации генетической информации — транскрипция. Гены эукариот транскрибируются в виде предшественника, который состоит из экзонов и интронов (незрелая иРНК). Затем интроны вырезаются специальными ферментами, а экзоны последовательно сшиваются друг с другом, формируя готовый для трансляции транскрипт (зрелая иРНК). Этот процесс получил название сплайсинга. Одна и та же последовательность ДНК может кодировать несколько различных белков, благодаря так называемому альтернативному сплайсингу (образование разных иРНК за счет изменения чередования соединения экзонов из одного первичного РНК-транскрипта).

После транскрипции или параллельно с ней незрелая иРНК подвергается дальнейшей модификации. К 5'-концу пре-иРНК с помощью фермента присоединяется метилированный остаток гуанина в 7-м положении пуринового кольца (процесс копирования). Считается, что кэп (шапочка) необходима для правильной ориентации и присоединения рибосом к иРНК перед началом трансляции. К З'-концу пре-иРНК также ферментативно присоединяется короткая нуклеотидная последовательность, состоящая из остатков аденина (полиаденилирование). Полагают, что поли-А-последовательность необходима для транспорта иРНК через ядерную мембрану в цитоплазму [626].

По выполняемой функции в клетке эукариотические гены делятся на несколько групп.

Первую группу составляют гены, экспрессирующиеся во всех типах клеток. Продукты их деятельности — белки, необходимые для обеспечения жизнедеятельности любой клетки организма (гены рибосомальных РНК, гистонов и др.).

Вторая группа — тканеспецифические гены, которые функционируют только в определенных типах клеток или тканях на определенных стадиях онтогенеза (гены глобулинов, альбумина, а-фетопротеина, иммуноглобулинов, мышечных белков, секреторных белков эндокринных и пищеварительных желез и многие другие).

Третью группу составляют гены, которые кодируют различные белки, участвующие в регуляции транскрипции (транскрипционные факторы). Белковые продукты этих генов взаимодействуют с регуляторными участками генов, вызывая усиление или подавление экспрессии.

К четвертой группе относят гены, экспрессия которых индуцируется внешними факторами, в том числе ксенобиотиками.

Одной из основных задач фармакогеномики является изучение экспрессии генов при различных заболеваниях и воздействии того или иного лекарства или биологически активного соединения. Это позволит определять возможность их направленной регуляции.

Успешное внедрение фармакогеномики в экспериментальную фармакологию стало возможным благодаря развитию соответствующих технологий в том числе и информационных (биоинформатика).

Все они ассимилировали и интегрировали фармакогенетику в широкое научное направление.

В целом, все методы ДГЭ состоят из множества, часто повторяющихся одних и тех же операций. Выполнение их вручную малоинтересное занятие. Однако угрозой не является монотонная работа оператора, а значительно большей проблемой считается бесконечное повторение одних и тех же операций, что может привести к потере точности. Поэтому перед фармакогеномическими технологиями стоит одна задача — частичная или полная автоматизация аналитических операций.

Основой любой технологии является метод, имеющий в аналитической практике свои характеристики (параметры). Для ДГЭ они должны соответствовать следующим требованиям:

— разрешающая способность, связана с определенной точностью определения соседних генов;

— чувствительность — граница «-последовательностей разведения, дающих возможность статистически достоверно регистрировать изменения ДГЭ;

— охват — процент экспрессированных генов данного вида экспериментальных животных или определенной ткани, которые могут быть надежно определены и экспериментально повторяться;

— фальшпозитивная норма — количество генов, ошибочно отнесенных к экспрессированным;

— фальшнегативная норма — количество экспрессированных генов, однако отнесенных к неактивным.

Технологии ДГЭ включают две группы методов. Одна из них, так называемая закрытая, а вторая — открытая архитектурная система [627].

Закрытая архитектурная система требует информацию о каждом гене или клоне и использует в качестве анализатора микрочипы.

Теория создания микрочипов основана на гибридизации олигонуклеотидов известной последовательности, иммобилизованных на твердой поверхности в строго определенных местах, с меченой различными способами пробой. Способствовали созданию данной технологии последние достижения в информатике, химии полупроводников, микроэлектронной промышленности, а также обилие информации, которая накопилась за годы работы над программой «Геном человека».

ДНК-чип — миниатюрная пластина с микроячейками. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированные олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам определенных генов, выступающих в качестве матрицы. В этих ячейках происходит комплементарное взаимодействие матрицы и пробы (кДНК исследуемых образцов). В настоящее время существует два направления в создании ДНК-чипов. Они различаются способом синтеза и нанесения матричных олигонуклеотидов [628].

Первое направление основано на предварительном синтезе олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезируют химически или с помощью ПЦР (длина от 500 до 5000 оснований) и затем наносят на обработанную специальным образом стеклянную поверхность с помощью роботов. Такие типы чипов получили название кДНК-микрочипов (cDNA-microarray). В ПЦР ампли- фицируются последовательности кДНК определенных генов. Поэтому данный тип чипов дорогостоящий, так как необходимо создавать собственную кДНК-библиотеку или приобретать ее у крупных исследовательских центров.

кДНК-Микрочипы оказались непригодными для проведения исследований полиморфизма (генетическая изменчивость отдельного локуса в определенной популяции), мутационного анализа, сравнительного изучения экспрессии большого количества генов, так как плотность размещения матричных олигонуклеотидов очень ограничена (число ячеек составляет = 1000 на чип). Кроме того, применение длинных фрагментов ДНК (кДНК) снижает специфичность гибридизации с исследуемой пробой и появляются ложноположительные сигналы, не соответствующие реальной экспрессии генов.

Несмотря на перечисленные недостатки, основное преимущество кДНК-микрочипов — возможность варьирования качественным и количественным составом фрагментов генов.

Более перспективное направление создания чипов — применение фотолитографических технологий [629], которые дают возможность одновременно интегрировать огромное количество олигонуклеотидов любой последовательности непосредственно на поверхности чипа. Плотность размещения синтезированных таким образом нуклеотидов может достигать 1 млн. на 1 см2. Такие чипы, получившие названия ДНК-чипов (DNA-chips), производятся фирмой Affymetrix Inc. Матрица ДНК-чипа — короткая (20—25-мерная) олигонуклеотидная последовательность, причем каждому гену соответствует 15—20 таких олигонуклеотидов, что значительно повышает точность и воспроизводимость результатов. ДНК-чипы позволяют одновременно оценивать экспрессию практически неограниченного количества генов, производить исследование полиморфизма, в том числе и однонуклеотидных замен (SNP). В этом случае синтезируются олигонуклеотиды, специфические для каждой последовательности конкретного гена, учитывая все возможные варианты взаимного расположения нуклеотидов.

При проведении исследований чип гибридизуется с меченой различными способами пробой. При сравнительных исследованиях пробой, как правило, служит кДНК, полученная из контрольного и сравниваемого образцов. В качестве метки используются как радиоактивно меченые молекулы, так и флуоресцентные красители, непосредственно присоединенные к исследуемым образцам. При проведении сравнительного анализа обычно применяют двухцветную детекцию, при которой контрольная и опытная кДНК метятся разными красителями. Результаты регистрируют по интенсивности гибридизационных сигналов тех ячеек чипа, где произошла гибридизация, с последующей компьютерной обработкой данных.

Производятся и упрощенные варианты чипов с небольшим набором генов (в пределах 1000—2000). На нейлоновой мембране фиксируются короткие последовательности известных генов. Они гибридизуются с радиоактивно меченой пробой. Гибридизация детектируется методом радиоавтографии.

Следует отметить, что работа с чипами требует специального дорогостоящего оборудования для проведения гибридизации. Ожидается, что в ближайшие годы цены на комплекты оборудования для производства чипов и работы с ними будут снижены в связи с насыщением рынка.

Разработка и внедрение в науку и практику новых технологий часто является движущим моментом в развитии медикобиологических отраслей знаний как, например, это было с разработкой в недавнем прошлом технологии ПЦР. Развитие молекулярной биологии в настоящее время многим обязано ПЦР, а теперь и микрочипам. Внедрение технологии микрочипов принципиально и для фармакологии. Разработка новых лекарственных средств уже сейчас начинает основываться на информации о функциональной роли определенных генов в развитии патологии. Поэтому сроки разработок могут сократиться с 10—15 до 5—8 лет [630).

Открытая архитектурная система не требует сведений о структуре гена или клона и делает возможным идентифицировать практически все процессы транскрипции во многих тканях. Более того, эти методы позволяют идентифицировать неизвестные гены, которые экспрессируются в условиях взаимодействия с лекарствами. Чувствительность методов (1:10 — 300 тыс.), широта охвата (60—90 %) колеблются в зависимости от уровня метода и необходимости его использования [631].

Открытая архитектурная система использует следующие методы:

— дифференциальный дисплей [632];

— серийный анализ ДГЭ (SAGE) [633];

— репрезантивный анализ (RDA) [634];

— метод вычитающей гибридизации [635];

— Gene Calling [636];

— общий анализ (TOGA) [637].

Метод дифференциального дисплея был разработан в 1992 году Р. Liang и A-Pardee. Авторы исходили из предположения, что в клетке экспрессируется 15 тыс. генов. В принципе, на основе каждой индивидуальной молекулы иРНК можно получить фрагмент кодирующей ее ДНК путем обратной транскрипции (кДНК). Затем этот фрагмент можно многократно воспроизвести методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). При постановки ПЦР авторы использовали необычную пару праймеров. Прямой праймер — короткая последовательность из 10 нуклеотидов произвольного состава — заякоривающий основания (произвольный праймер). Обратный праймер состоял из двух частей. К нескольким остаткам дезокситимина (оли- ro-dT) присоединяются два дополнительных нуклеотида произвольного содержания. Наличие олиго-dT последовательностей позволяет выделить только поли-А содержащую иРНК. Одновременно она является затравочной молекулой в реакции обратной транскрипции. Прямой праймер позволяет синтезировать большое разнообразие кДНК разной длины. Это связано с тем, что возможность локализации данной последовательности в одном и том же месте в иРНК, транскрибированных с разных генов, крайне мала.

После амплификации набор кДНК разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле и проводят сравнительный анализ различных фрагментов электрофореграмм в опытных и контрольных образцах. Интересующие фрагменты выделяют из геля, определяют путем секвенирования первичную структуру кДНК, проводят компьютерный анализ и с помощью банков данных нуклеотидных последовательностей идентифицируют выявленные гены [621].

Если использовать большое количество прямых произвольных праймеров, варьируя их нуклеотидный состав, и изменять все возможные сочетания двух пар нуклеотидов в Т-якорном праймере, то можно получить информацию о значительном числе транскриптов.

Метод дифференциального дисплея относительно простой в исполнении, не требует больших затрат, средств и времени, позволяет работать с небольшим количеством исходного материала, из-за чего нашел широкое применение в научных исследованиях. Однако этот метод имеет ограничения и недостатки. Во-первых, праймеры, которые применяются в ПЦР, имеют низкую температуру гибридизации с матрицей (что около 2 % экспрессированных генов являются причиной ожирения. Использование лектина в течение недели приводило к нормализации показателей только у 10 %. Благодаря этому методу были идентифицированы в гипофизе ранее неизвестные гены и установлены некоторые механизмы взаимодействия генов и лектина, что сказывалось впоследствие на регуляторной функции, например на уровне адренокортикотропного гормона [640].

Клинические последствия взаимодействия лекарств в результате генной экспрессии могут быть проиллюстрированы на примере препаратов резулин, косикор и тасмар [641]. Каждый препарат в свое время прошел полные доклинические и клинические испытаня, в которых не было обнаружено отрицательного действия этих лекарств. Впоследствии оказалось, что у незначительной части пациентов, в частности тех кто употреблял резулин (35 из 600 тыс. пациентов) наблюдалось поражение печени.

Детальное исследование причин токсичности препаратов показало, что в некоторых случаях происходит экспрессия генов с последующим нарушением активности CYP4503A4. Образующиеся метаболиты резулина или косикора могут взаимодействовать с другими препараты, которые употребляли пациенты, вызывая гепатотоксичные эффекты.

Специалисты в области фармакогеномики интенсивно работают еще в одном перспективном направлении, связанном с применением микрочипов, а именно, возможностью массового скрининга вновь синтезированных химических соединений на предмет проявления специфической биологической активности. Потенциальные лекарственные средства можно отбирать на основе сопоставления характера экспрессии с известными, сходными по механизму действия лекарственными средствами («эталонами»), В таких случаях информация обо всех химических соединениях, обладающих характерным профилем экспрессии, суммируется в компьютерных базах данных.

Для сопоставления эффектов различных веществ, создается матрица расстояний на основе корреляции тех генов ДГЭ, которых отличается более чем в 3 раза в любом эксперименте. Кластеризацию рассчитывают с помощью соответствующих программ, например, KITCH. Формирование кластеров лекарственных препаратов на основе информации о профиле экспрессии генов идентично подходу с анализом «структура—активность».

В связи с регуляцией экспрессии генов, имеющих непосредственное отношение к фармакологии отметим еще два методических подхода, дающих возможность манипулировать их активность. Во-первых, это создание (синтез) РНК-репрессоров с антисмысловой последовательностью нуклеотидов. Такие технологии используют преимущественно короткие антисмысловые последовательности. Основным методом выбора олигонуклеотидов является «прогулка по мРНК». Особое внимание к этой технологии возросло в связи с официальным разрешением в 1998 г. первого лекарственного средства, созданного на основе молекулы тиофосфатного аналога олигодезоксирибонуклеотида, используемого для лечения цитомегаловирусных инфекций [642].

Во-вторых, стратегии псевдокомплементарности пептид- ноолигонуклеотидных синтетических полимеров с успехом используются в борьбе с антибиотикорезистентными микроорганизмами.

Наличие большого количества генов в организме эукариот, являющихся объектом исследования фармакогеномики делает необходимым создание структуры, позволяющей искать, собирать, перерабатывать и сохранять соответствующую информацию. Круг интересов геномики, в целом, определяет биоинформатика. Ее составной частью по аналогии с хемоинформатикой служат большие библиотеки.

Экспериментальный поиск одного гена занимает недели и месяцы работы целой лаборатории. Компьютерные подходы сделают это за считанные минуты, если определена последовательность нуклеотидов организма или имеются надлежащие алгоритмы поиска. Различные программы биоинформатики используют для поиска генов, поиска регуляторных сигналов в ДНК, предсказания структуры и функции белка, его локализации в клетке, профилей ДГЭ, для реконструкции метаболизма. Реконструкция метаболических реакций, происходящих в разных клетках и тканях, будет одним из следствий расшифровки генетической информации.

Разрабатывается также направление применения микрочипов с целью выявления лекарственного полиморфизма, лежащего в основе разнообразия индивидов на один и тот же лекарственный препарат (раздел 10.1).

В целом, биоинформатика обеспечивает соответствующими информационными материалами не только фармакологию (R&D), но и целый ряд биологических дисциплин (рис. 12.6).

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004

Еще по теме ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ:

  1. Поиск генов-кандидатов, ассоциированных с АГ
  2. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ПГ ГРУПП Е И F ИЗ ЖИВОТНЫХ ОБЪЕКТОВ
  3. Реферат. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах дифференцировки и развития2009, 2009
  4. 2.6. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ДИЗАРТРИИ. 2.6.1. Дифференциальная диагностика по локально-диагностическим признакам
  5. Дифференциальный диагноз
  6. Дифференциальный диагноз
  7. Дифференциальный диагноз
  8. Дифференциальный диагноз
  9. Дифференциальный диагноз
  10. Дифференциальный диагноз
  11. Дифференциальный диагноз
  12. Дифференциальный диагноз
  13. Дифференциальный диагноз
  14. Дифференциальный диагноз
  15. Дифференциальный диагноз
  16. Дифференциальный диагноз
  17. Дифференциальный диагноз