<<
>>

ЭСТЕРАЗЫ

В эту подгруппу включены несколько ферментов, обладающих сравнительно широкой специфичностью. Они, катализируя разрыв эфирных связей, гидролизуют очень большое число различных сложных эфиров, хотя и не с одинаковой скоростью.

Некоторые из них в известной мере действуют также и на лактоны. Ряд ферментов представлены в определенной ткани множественными формами, незначительно отличающимися по специфичности, а у соответствующих ферментов из различных видов экспериментальных животных часто наблюдаются различия в специфичности. Имеются также перекрывания в специфичности с некоторыми ферментами, относящимися к другим группам. Так 4-нитрофенилацетат, широко используемый для обнаружения эстеразной активности, гидролизуется также более специфичными эстеразами, например ацетилхолин- эстеразой, и протеолитическими ферментами, например химо- трипсином.

Простые эстеразы катализируют гидролиз незаряженных субстратов; они специфичны главным образом в отношении длины и формы углеводородных цепей по обе стороны от эфирной связи. Другие эстеразы различаются на основе таких критериев, как способность гидролизовать ароматические эфиры или способность ингибироваться фосфорорганическими соединениями [287]. Так, карбоксилэстеразы гидролизуют как ароматические, так и алифатические эфиры и ингибируются DFP; арилэстеразы слабо действуют на алифатические эфиры и не ингибируются DFP.

Эфиры карбоновых кислот и арилэфиры также гидролизуются в организмах животных и человека эстеразами. Альдридж [288] классифицировал эстеразы как Л и В. Эстераза А со значительно большей скоростью гидролизует п-нитрофенилацетат, чем эфир бутирата, и не ингибируется параоксоном. Эстераза В ингибируется параоксоном (10~7—1СГ* моль/л) и гидролизует «-нитрофенилбутират быстрее, чем ацетат. Кроме того, эстераза А гидролизует параоксон до диэтилфосфорной кислоты и «-нитрофенола [289]. На основании этих данных эстераза А называется арилэстеразой или параоксоназой (PON), а эстераза fi-карбоксилэстеразой, метилбутиразой, монобутиразой.

Арилэстераза в большей степени локализована в органах и тканях животных и в меньшей — в плазме крови. Фермент, выделенный из плазмы крови овцы и очищенный в 385 раз, имеет молекулярную массу 35—50 кД [290]. Для параоксона константа Михаэлиса эстеразы равна 4,2 ммоль/л (для сыворотки крови Кт = 0,2 ммоль/л). Очевидно, в процессе очистки разрушается фактор, активирующий в нативном состоянии фермент. Очищенный фермент ингибируется на 50 % 0,63 мМ раствором Ва2+ и 0,2 мМ раствором ЭДТА [291].

По активности различные формы арилэстеразы отличаются друг от друга в зависимости от величины pH, чувствительности к ионам и местом локализации. В растворимой, микросомной и митохондриальной фракциях гепатоцитов крыс общая ферментативная активность к параоксону составляла 71:34:7 при pH 8,8 и 22:49:8 при pH 7,7. В плазме крови человека [292] и кролика [293] обнаружены разновидности ферментов, катализирующих различные субстраты при строго определеных значениях pH.

Кроме параоксона, параоксоназа инактивирует такие ксенобиотики как фосфоорганические соединения, органофосфаты, карбаматы, эфиры уксусной кислоты. Эти соединения широко применяются в сельском хозяйстве и промышленности, используются в качестве лекарственных средств (антихолинэстераз- ные препараты — параоксон, армии), а некоторые из них являются боевыми отравляющими веществами (зарин, заман, табун).

Выделено три изофермента параоксоназы: PON1, PON2 и PON3. Наибольшее значение в метаболизме ксенобиотиков принадлежит PON1. В настоящее время известна аминокислотная последовательность и количество аминокислотных остатков (354), входящих в состав PON1. Молекулярная масса фермента составляет 39 кД. Идентифицирован ген, кодирующий PON1, находящийся в седьмой хромосоме человека, локусе 7q21.3. Локализуется фермент в основном в плазме крови и связан с липопротеинами высокой плотности.

В 90-е годы прошлого века были идентифицированы [294] мутации, приводящие к генетическому полиморфизму PON1. Наиболее распространенной мутацией, обусловливающей изменение активности фермента, является замена в 192 положении глутамина на аргинин (Glnl92Arg), которая наследуется по аутосомному рецессивному типу.

У гомозигот по мутации Glnl92Arg активность PON1 (субстрат параоксон) значительно выше, чем в группе без мутации, в отношении других субстратов (хлопирофос, диазинон, зарин, заман) активность фермента у гомозигот по этой же мутации ниже чем у лиц не имеющих ее. Таким образом, авторы [294] делают вывод о том, что носители этой мутации, особенно гомозиготные пациенты, более чувствительны к фосфороргани- ческим соединениям. Распространенность гомозигот по мутации Glnl92Arg среди испанского населения составляет 16 %, среди североевропейцев — 9 %, а среди японцев — 41,4 % [295]. Именно это обстоятельство послужило причиной значительных жертв при применении зарина во время террористического акта в токийском метро в марте 1995 года.

Следует отметить антиатерогенную роль PON1. Находясь в участках с липопротеинами высокой плотности, фермент инактивирует окисленные липиды. Экспериментным подтверждением этого факта явилась работа [297], в которой было показано, что у мышей, лишенных гена PON1 на фоне гиперхолистери- новой диеты быстрее развивался атеросклероз сосудов, чем у животных имеющих этот ген.

В целом фосфорорганические вещества гидролизуются с помощью ферментов, атакующих эфирные связи или действующих на ангидриды кислот по трем типам:

S S

II II

(R0)2P-X + H20^(R0)2P0H + HX, (8.31)


S(O) S(O)

II II

(RO)2 Р-Х + Н20 — (RO) (ОН) Р—X + ROH, (8.33)

где R — алкильная, а X — элиминирующая группы (алкокси, арилокси и др.). В результате реакций 8.31 и 8.32 образуются диалкилфосфорнотионовая и диалкилфосфорная кислоты соответственно, а для 8.33 — деалкильное производное (спирт).

Карбоксилэстеразы образуют ряд ферментов, катализирующих реакции гидролиза ароматических и алифатических эфиров. Они отличаются от липаз тем, что гидролизуют водорастворимые субстраты, в то время как последние действуют на границе раздела фаз вода/эфир и расщепляют преимущественно внешние эфирные связи.

Влияние изменений в ацильной и алкильной частях молекулы субстрата на активность карбоксилэстеразы до некоторой степени различно. С удлинением ацильной части молекулы сродство и реакционная способность сначала увеличивается параллельно, вплоть до цепи с 4—5 углеродными атомами, но дальнейшее увеличение длины цепи вызывает уменьшение реакционной способности, хотя сродство продолжает быстро возрастать (по крайней мере до 10 углеродных атомов).

При удлинении алкильной цепи до 4—6 углеродных атомов также наблюдается параллельный рост сродства и реакционной способности; однако дальнейшее увеличение длины цепи вызывает снижение обоих показателей. У эфиров с относительно короткими цепями алкильная группа оказывает гораздо большее влияние на сродство, чем ацильная группа, тогда как для реакционной способности характерны обратные соотношения. С повышением степени разветвленности цепи резко возрастает сродство и несколько снижается реакционная способность.

У предпочтительных субстратов на обоих концах молекулы находятся неполярные группы. Фениловые и нитрофениловые эфиры являются хорошими субстратами. Гидролизуются также некоторые циклические соединений, такие, как бутиролактон и оксазолины. Представленные данные послужили основанием для прогнозирования строения активного центра карбоксиэсте- разы [287].

Очищенная карбоксилэстераза кишечника человека с высокой скоростью гидролизует аспирин [297], а фермент плазмы крови кролика, свободный от арилэстеразы и холинэстеразы катализирует расщепление кокаина [298]. Гидролиз прокаина и аналогичных местных анестетиков был предметом обсуждения в обзорной статье [299]. Показано, что те вещества, которые слабо или вообще не подвержены гидролитическому расщеплению, например мепивакаин, в общем более токсичны, чем быстро гидролизующиеся. Такое заключение послужило основанием для выделения в отдельный фермент разновидности карбоксилэстеразы. Его назвали «атропинэстеразой». Отсутствие этого фермента в организме некоторых кроликов приводит к появлению судорог у животных после введения им прокаина [300].

Карбоксилэстераза — чрезвычайно важный фермент, участвующий в метаболизме многочисленных фосфорорганических инсектицидов. Наибольшая информация получена для фермента, катализирующего гидролитическое расщепление малатиона, продуктом которого является соответствующая монокарбоно- вая кислота [301]. Он обнаружен в печени, почках, легких, селезенке, плазме крови крыс, мышей, морских свинок, собак и человека. Активность фермента ингибируется аналогами пара- тиона — хлортионом, диазиноном, систоном и фоздрином.

Определенный вклад среди эстераз в общий процесс метаболизма соответствующих лекарственных средств вносит и холинэстераза. Ферменты, гидролизующие эфиры холина, относятся к группе сериновых ферментов, сильно ингибируемых DFP и алкалоидом эзерином. Хотя эти ферменты были предметом интенсивного исследования, только небольшое их число получено в высокоочищенном состоянии. Еще в начале 40-х годов прошлого столетия было высказано предположение [287] о том, что существуют два основных типа этих ферментов, названных «истинными холинэстеразами» и «псевдохолинэстеразами». Они существенно различаются по кинетическим и другим свойствам, а также имеют большие различия в специфичности, хотя как те, так и другие гидролизуют ацетилхолин. С целью типирования этих двух типов холинэстераз используют маркерные субстраты — бензоилхолин, бутирилхолин, ацетил-(3-метилхолин.

Весьма детальные исследования специфичности рассматриваемых ферментов проведены на примере специфичности аце- тилхолинэстеразы из эритроцитов и плазмы человека. Хотя были использованы лишь частично очищенные препараты ферментов, удалось, однако, показать, что каждый из ферментов гидролизует как холиновые, так и нехолиновые эфиры. Варьируя длину ацильной цепи, присоединенной к холину, показано, что скорость расщепления эфиров холина под действием аце- тилхолинэстеразы резко уменьшается с увеличением длины цепи: бутирилхолин гидролизуется со скоростью равной только 1—2 % скорости ацетилхолина. С холинэстеразой дело обстояло как раз наоборот — в этом случае бутирилхолин гидролизовался вдвое быстрее, чем ацетилхолин. Изменение длины ацильной и алкильной цепей также влияло на скорость гидролиза нехолиновых алифатических эфиров, катализируемого ацетилхолинэстеразой и холинэстеразой. При изменении длины алкильной цепи (ацильная часть — ацетат) влияние было в общем сходным для обоих ферментов. Подобные результаты были получены и при изучении гидролиза эфиров других групп. Однако при изменении длины ацильной цепи (алкильная группа одна и та же) между холинэстеразами наблюдалось выраженное различие: ацетилхолинэстераза имела отчетливый оптимум с двухуглеродной ацильной группой (ацетат) и нулевую активность в случае бутирата, тогда как у холинэстеразы, наоборот, резкий максимум приходился на бутират.


Имеется много фактов [287], указывающих на то, что обе холинэстеразы обладают особым сродством к метильным группам; поэтому разветвление алкильной цепи увеличивает атаку- емость эфиров ферментами (за исключением случая разветвления у углеродного атома, стоящего рядом с эфирной группой). Оптимальной алкильной группой в обоих случаях является, по- видимому, 3,3-диметилбутильная группа, которую можно рассматривать как углеродный аналог холина:

3,3-диметилбутилацетат

Интересно отметить, что для действия обоих ферментов наличие заряженного атома азота, имеющегося в молекуле холина, не является обязательным, и одним из самых важных факторов оказывается форма молекулы. В то же время холинэстераза обладает более высокой специфичностью, нежели ацетилхолинэстераза: скорость гидролиза углеродного аналога холина при действии ацетилхолинэстеразы составляет 60 % скорости гидролиза ацетилхолина, а при действии холинэстеразы — только 35 %.

Холинэстеразы, подобно карбоксилэстреразе, гидролизуют наряду с алифатическими также и ароматические эфиры, часто с весьма высокой скоростью.

Холинэстераза (бутирилхолинэстераза) наряду с гидролизом ацетилхолина, оказывает аналогичное действие на сукса- метоний (деполяризующий миорелаксант), который широко применяется в анестезиологии. Фермент обнаружен во всех клетках кроме эритроцитов. Особенно большое его количество определяется в эмбриональной и плодной ткани головного мозга, опухолях: ганглиобластоме, нейробластоме, менингиоме.

Молекулярная масса фермента составляет 68 кД, количество аминокислотных остатков — 602. Ген холинэстеразы
и.'їходится в третьей хромосоме (3q26.1—q26.2). Генетические исследования [302], проведенные с помощью ПЦР, позволили выявить ряд мутаций гена холинэстеразы. Повышенная чувствительность к суксаметонию наблюдается только у гомозигот. Наиболее распространенной мутацией, приходящей к синтезу фермента со сниженной активностью, является замена в нуклеотидной последовательности в положении 209 аденина на гуанин. Другой мутацией, приводящей к синтезу холинэстеразы с резко сниженной активностью, является «вставка» в 117 кодоне нуклеотидной последовательности. Результатом ее является синтез белка, который составляет собой лишь 22 % размера нормального фермента. Гомозиготы по этой мутантной аллели также проявляют повышенную чувствительность к суксаметонию. Еще одна мутация, приводящая к синтезу холинэстеразы со сниженной активностью — замена в положении 243 треонина аминокислотной последовательности на метионин. В результате синтезируется фермент, который в литературе называют фторрезистентной холинэстеразой 1. Гомозиготы по этой мутантной аллели также проявляют повышенную чувствительность к суксаметонию, однако период апноэ у пациентов длится около 30 мин.

Фенотипирование холинэстеразы для определения ее сниженной активности осуществляется с помощью так называемого «дибукаинового теста», основанного на подавлении активности фермента дибукаином в стандартных условиях. У людей с нормальной активностью холинэстеразы дибукаиновое число равно 88 %. У людей — гомозигот по мутантным аллелям, которые определяют сниженную активность фермента, оно равно 20 %, а у гетерозигот по этим аллелям — 60 %. Следовательно, дибукаиновый тест позволяет не только выявить лиц с повышенной чувствительностью к препарату, но и гетерозигот, что важно для профилактики осложнений у потомства.

8.3.2.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме ЭСТЕРАЗЫ:

  1. 8.3. ГИДРОЛИЗ
  2. Другие превращения в организме
  3. Диагноз
  4. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  5. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ АНАФИЛАКСИИ
  6. Классификация
  7. 8.3.3. АМИДАЗЫ
  8. Компоненты комплемента
  9. Инъекционные препараты. Эфиры анаболических стероидов
  10. УЧАСТИЕ КОМПЛЕМЕНТА В МЕХАНИЗМЕ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
  11. Тестостерона ундеканаат (таВлетки
  12. Классификация
  13. ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
  14. Механизм действия, местных анестетиков
  15. ИНГИБИРОВАНИЕ, АКТИВАЦИЯ И ИНДУКЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
  16. Характеристика типов аллергических реакций