<<
>>

ФЕРМЕНТНЫЕ СВОЙСТВА МИОГЛОБИНА И ГЕМОГЛОБИНА

Положение таких макромолекул как миоглобин (Мв) и гемоглобин (Нв) в обсуждаемой проблеме неоднозначно. С одной стороны, их взаимодействие с ксенобиотиками можно квалифицировать как неферментативные процессы. С другой стороны, если Нв катализирует НАДФН-зависимое окисление анилина и его производных [168], то такую реакцию можно отнести

к ферментативной. Отметим, что наблюдаемое явление не является исключением в биохимии чужеродных соединений. Например, очищенный сывороточный альбумин человека катализирует гидролитическое расщепление эфиров, включая ацетилсалициловую кислоту [169].

Скорость такой реакции не меняется при использовании ингибиторов холинэстеразы.

Следовательно все перечисленные белки, скорее всего, можно отнести к ферментомиметикам.

По своей структуре Мв и Нв относятся к гемопротеинам и выполняют главную физиологическую функцию — транспорт кислорода. Если Мв состоит из одной полипептидной цепи и гема, то Нв представлен двумя а- и двумя р-цепочками.

В отличие от CYP, у которого пятое координационное положение порфирина занято цистеином, в молекулах Мв и Нв, также как у пероксидазы и каталазы, содержится остаток гистидина. Для мутантных Нв отмечена замена гистидина на тирозин.

Если пероксидаза, каталаза и CYP450 в функционирующем состоянии содержат гемин, то Мв и Нв — гем. В отсутствие кислорода они называются дезоксигемоглобином и дезоксими- оглобином, а в связанном с кислородом состоянии оксигемогло- бином (Нв02) и оксимиоглобином (Мв02). Кислород в Нв02 в определенных условиях может замещаться такими нейтральными лигандами как СО (карбоксигемоглобин) или N0.

Все нейтральные лиганды связываются только с гемовой частью молекулы Нв. В тоже время белковая часть обеспечивает обратимое, без окисления железа (Fe2+ —»• Fe3+), связывание кислорода. Она также способствует регулированию этого процесса и освобождению кислорода.

В некоторых случаях Мв и Нв могут превращаться в гемопротеины, содержащие железо в трехвалентном состоянии, т. е. окисляться. Окисленный Нв называют метгемоглобином (Met Нв), а нарушение — метгемоглобинемией.

Возможны, по крайней мере, три причины, обусловливающие образование Met Нв в эритроцитах:

1. Если в эритроцит попадает ксенобиотик, то в случае недостатка глутатиона (понижение скорости синтеза или нехватка глутатионпероксидазы) образуется перекись водорода, повреждающая Нв.

2. Самопроизвольное (автоокисление) Нв в процессе транспорта кислорода. Так ежедневно около 0,5 % Нв превращается в Met Нв. Предотвращает этот процесс гемоглобин-редуктаза. Аналогичную функцию выполняет система, использующая в качестве кофактора НАДФН.

3. Врожденные аномалии Нв. Их насчитывают пять и они характеризуются тем, что у каждого из них в области гемового кармана имеется замена аминокислоты, что создает предпосылку для процесса Fe2+ —► Fe3+.

Метгемоглобинемия может быть обусловлена и редкой врожденной недостаточностью метгемоглобин-редуктазы. В этом случае 25—40 % всего Нв может находиться в виде Met Нв, что сопровождается цианозом.

Представленные факты отражают только некоторые физико-химические свойства и функциональное состояние Мв и Нв, но они не раскрывают сути их действия в качестве ферментов окисляющих лекарства. В настоящее время выделяют несколько типов реакций в которых Мв и Нв могут генерировать активные формы кислорода: 1) автоокисление; 2) пероксидазные реакции; 3) монооксигеназные реакции; 4) реакции соокисле- ния.

Понятно, что процессы 2—4 носят несколько условное название.

1. Способность к автоокислению имеют только Мв02 и Нв02. Однако по сравнению с пероксидазами и различными изоформами CYP450 эти оксиформы гемопротеинов характеризуются в нормальных условиях большой устойчивостью [161]. Это объясняется функциональными особенностями Мв и Нв, так как главная их задача транспортировать, а не активировать 02.

В настоящее время предполагается [168] наличие трех возможных механизмов окисления Нв02:

Нв02 + Н20 — Met НвОН2 + 02, (8.1)

Нв02 + Нв —*■ Нв02Нв + 2 Met Нв + 02, (8.2)

Нв02 + Н (или е-) —>■ Met НвОН2 —► продукты. (8.3)

Реакция 8.1 характерна для целого ряда железопорфиринов. Однако, только в зависимости от величины окислительно-восстановительного потенциала Fe2+/Fe2+ гемопротеины способны генерировать супероксид — анион. Реакция становится главной, если этот потенциал ниже чем у Нв (Е0 при pH = 7,4 составляет + 0,2 В). Как правило такое снижение достигается заменой аксиального лиганда. Реакция 8.2 маловероятна, так как белок препятствует димеризации Нв и Нв02.

Наиболее изучена и часто встречающаяся реакция окисления Нв02 с участием доноров атома водорода или электрона (8.3). Такими донорами могут быть органические восстановители (анилин, фенилгидразин, фенол и др.). Установлено, что Нв02 окисляет эти вещества по радикальному механизму. Так Нв02 с большой скоростью окисляет фенилгидроксиламин до нитробензола соответственно реакциям 8.4—8.8 [170].

Нв02 + С6Н5—NHOH — НвООН" + С6Н5—N+—ОН, (8.4)

НвООН” + С6Н5—NHOH — Met Нв + 20Н“ +

+ C6H5-N-OH, (8.5)

НвООН- + С6Н5—N —ОН — Met Нв + 20Н" +

+ О2- + С6Н5—N+—ОН, (8.6)

С6Н5—N+—ОН + ОН" - С6Н5—N = ON + Н20, (8.7)

С6Н5—N+—ОН + 1/2 О2- — С6Н5—N = О + Н20. (8.8)

Имеются также сведения [170] о том, что N-алкилфенилгид- роксиламины и N-бензилфенилгидроксиламины в реакциях с Нв02 образуют нитрены. Алифатические спирты не окисляются в этой системе, так как значительно хуже диссоциируют чем гидразины и поэтому являются более слабыми донорами электронов.

Необходимо также подчеркнуть, что различные изоформы CYP450 в оксигинированном состоянии не способны окислять субстраты. Для проявления такой активности им необходимы путидаредоксин (бактерии) или цитохром Ь5 (животные).

2. Пероксидазные реакции Мв и Нв напоминают процессы, катализируемые пероксидазами и каталазами. Для различных изоформ CYP также наблюдается способность окисления лекарств с использованием гидроперекисей, (но не Н202). Следовательно, для многих железосодержащих гемопротеинов характерным является каталитическое действие в реакциях переписного окисления ксенобиотиков. Учитывая тот факт, что механизмы окисления ксенобиотиков с участием Мв и Нв в присутствии Н202 и ROOH близки, мы остановим наше внимание только на перекиси водорода.

Число реакций переписного окисления ксенобиотиков Мв и Нв значительно: деалкилирование N-алкиламинов (димети- ланилин, диметил-л-толуидин, аминопирин), ароматическое гидроксилирование (ацетанилид, л-толуидин, анилин и др.) [161, 171]. При взаимодействии этих гемопротеинов с Н202 зарегистрированы спектры идентичные спектрам комплекса 1 (FeO3*) ряда пероксидаз. Этот факт, а также данные ЭПР-спектро- скопии комплекса, кинетические и энергетические параметры при окислении одного и того же субстрата в системах перокси- даза—Н202 и Нв—Н202 предполагают существование в обоих случаях исходного окисляющего агента.

При взаимодействии Нв с Н202 образуется Met Нв, дающий комплекс I (Met Нв — Н202).

Однако, в отличие от комплекса I пероксидаз (раздел 8.1.1.2) он нестабилен и быстро превращается в комплекс II (FeO2-). Комплекс II принимает электроны от восстановителей, субстратов и продуктов реакции. Так, анилин и фенол с высокой скоростью окисляются этой системой, а ацетанилид и л-толуидин — с низкой. Соответственно гидрохинон, являясь более сильным восстанавливающим агентом, чем ами- нофенол лучше окисляется комплексом II [172, 173].

Аскорбиновая кислота и НАДН предотвращают дальнейшее окисление продуктов реакции при участии Нв. Предполагается, что эти соединения конкурируют с ксенобиотиками в качестве восстановительных агентов комплекса II.

Гидроксилирование анилина осуществляется с высокой скоростью при использовании Met Нв, а не Нв02. Для фенола наблюдается обратная картина. Объясняется такое различие типом гидроксилирующих частиц, генерирующими этими гемопротеинами [171].

3. Кровь человека, также как и эритроциты или гемолизаты человека, свиньи, кролика, барана катализируют типичную реакцию цитохром Р450-зависимых монооксигеназ (например, превращение анилина в n-аминофенол). Плазма крови из перечисленных источников оказалась не эффективна по отношению к этому субстрату. Для эритроцитов человека и барана отмечена линейная зависимость образования n-аминофенола от срока времени инкубации и концентрации Нв [174]. В этой реакции в качестве субстратов также были использованы фенол, N-мети- ланилин, о- и ж-толуидин. Наибольшую активность проявляли эритроциты по отношению к N-метиланилину (реакция N-деме- тилирования). Что касается реакции ароматического гидрокси- лирования, то использованные субстраты составляли следующий ряд: анилин > фенол =ж-толуидин > о-толуидин. Производные анизола (п-нитроанизол, n-анизидин), являясь субстратами О-деметилирования, не давали продуктов реакций даже в том случае, когда в инкубационную среду вносились глюкоза и метиленовый синий. Этот факт — необычен, так как существуют данные о способности эритроцитов катализировать реакцию О-деметилирования О-метилкатехолов [175].

Известно, что даже в тетрамерном Нв взаимодействие лигандов с а- и Р-субъединицами может заметно различаться. Следовательно представляет определенный интерес определить вклад каждой субъединицы Нв в гидроксилирование ксенобиотиков. Такие данные приведены в работе Миела и сотрудников [174] и представлены в таблице 8.9.

Если сложить активности а- и Р-субъединиц и разделить на 2 (в таблице 8.9 они представлены в виде тетрамеров, а не димеров, как в случае Met Нв), то окажется, что цепи составляют только 1/3 часть анилингидроксилазной активности Met Нв. Значит, только в сочетании Р^" субъединицы оказывают наибольшую активность. В пользу такого заключения свидетельствуют исследования скоростей гидроксилирования анилина а-семи- гемоглобином. В этом случае Р°, т. е. такая цепь лишена гема.

В последние годы разработаны методы, позволяющие получить «валентные гибриды» из нормального Нв, содержащего в одной из цепей Fe3+. Следовательно, в этих гибридах только один тип цепи (Fe2+) может взаимодействовать с кислородом или окисью углерода. Таким образом, появляется возможность наблюдать влияние лиганда, связавшегося с одной цепью на другой тип субъединицы в нормальном Нв.

Сравнивая активность анилингидроксилазы а- и Р-ферригиб- ридов можно заметить значительное преобладание последнего (таблица 8.9). По-видимому, для проявления анилингидроксид- ной активности Нв необходима его четвертичная структура. Кроме того, наиболее чувствительной в этом плане является P-цепь гемопротеина.

Таблица 8.9

Анилингидроксилазная активность Нв и его субъединиц

п/п

Гемоглобин или его производные Активность

(р моль л-аминофенола/мин)

1 О I О I

Метгемоглобин (ос’ 2$ 2)

74,7 ± 2,9
2 Альфа субъединица (ос3*^) 31,3 ± 1,35
3 Бета субъединица (Р3-1^) 9,9 ± 1,1
4 а-семигемоглобины (а^Р^) 20,7 ± 3,3
5 а-ферригибрид [а3+2(р2+—СО)г] 38,1 ± 2,6
6 p-ферригибрид |(а2+—СО)2р3+2І 75,9 ± 2,0

Для понимания некоторых сторон механизм действия Нв, как терминальной оксидазы в монооксигеназном катализе, были проведены исследования с использованием реконструированной системы CYP450. Принцип реконструирования ферментных систем достаточно хорошо разработан и широко применяется в биохимии.

Частично реконструированная монооксигеназная система печени крыс состоит из следующих компонентов [176]: CYP450 (1 мкм), НАДФН (1 мм), НАДФН-цитохром с редуктазы (0,05 е), фосфатодилхолин (50 мкг/мл). Для Met Нв (1 мкм) были использованы те же компоненты, исключая фосфатидил- холин. Для проявления гидроксилазной активности CYP450 необходимы липиды [132]. Для Met Нв нет такой необходимости, так как этот гемопротеин находится в растворимой форме в цитозоле клетки. В качестве субстрата в обоих случаях был использован анилин.

Оказалось, что гидроксилирование анилина в реконструированных системах проходит с одинаковой скоростью: микросомы печени крыс — 0,22; Met Нв человека — 0,20; Met Нв кашалота — 0,08 мол n-аминофенола/мин на 1 мол. гемопротеина. Удивительным оказался тот факт, что перечисленные выше показатели были в 10—100 раз выше, чем у нерекон- струированных эритроцитов. Очевидно предложенная система не в полной мере отражает сущность каталитического действия Нв в клетке.

Тем не менее участие Нв в монооксигеназном катализе возможно, так как и для CYP450 необходимо наличие 02, НАДФН и НАДФН-ц«/пол:рол( с редуктазы. Реакции окисления ксенобиотиков ингибируются окисью углерода. Отмечена также линейная зависимость между скоростями реакции гидроксилирова- ния и концентрацией Нв.

Общие вопросы, касающиеся соокисления лекарственных средств в организме экспериментальных животных и человека и участие в этих процессах Мв и Нв будут освещены в разделе 8.1.1.5.

В заключение следует отметить, что представленные данные свидетельствуют о необычных свойствах Мв и Нв, заключающихся в генерации активных форм кислорода и способствующих окислению ряда органических веществ. Очевидно, не следует искать физиологическое объяснение этому процессу, однако учитывать его необходимо.

8.1.1.5.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004

Еще по теме ФЕРМЕНТНЫЕ СВОЙСТВА МИОГЛОБИНА И ГЕМОГЛОБИНА:

  1. ИНТЕГРАЦИЯ ФЕРМЕНТНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ
  2. Уровень эритроцитов и гемоглобина
  3. ГЕМОГЛОБИНЫ, БИЛИРУБИН.
  4. Типы гемоглобина
  5. Наследственное персистирование фетального гемоглобина
  6. Кристаллы гемоглобина С
  7. СРЕДНЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ
  8. Структура, функции, особенности биосинтеза и типы гемоглобина
  9. Наследственные гемолитические анемии, связанные с нарушением структуры или синтеза гемоглобина (гемоглобинопатии)
  10. Фармакологическое усиление синтеза фетального гемоглобина у больных гемоглобинопатиями
  11. Электрофизиологические свойства
  12. Электрофизиологические свойства
  13. Электрофизиологические свойства
  14. Электрофизиологические свойства
  15. Электрофизиологические свойства