<<
>>

ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ СООКИСЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Термин «соокисление» в биохимии ксенобиотиков появился относительно недавно. Этому способствовали исследования биотрансформации ксенобиотиков в семенных пузырьках барана. Известно, что в них содержится значительное количество простагландинов, образование которых катализируется про- стагландинсинтетазой. Однако, на некоторых этапах биосинтеза простагландинов участвуют и монооксигеназы (раздел 10.1.2), содержащие цитохром Р450 [133]. Поэтому до определенного времени считалось, что окисление ксенобиотиков в семенных пузырьках катализируется монооксигеназами.

Вместе с тем, в последнее время накопилось достаточное число экспериментальных данных, опровергающих такое представление. Их можно свести к следующим пунктам: 1) в микро- сомах семенных пузырьков барана цитохром Р450 отсутствует; 2) набор метаболитов ксенобиотиков в семенных пузырьках отличается от продуктов реакций, протекающих в микросомах печени животных; 3) НАДФН не оказывает влияния на скорость реакции окисления ксенобиотиков; 4) метгемоглобин ускоряет реакции окисления субстратов.

Более того, окисление ксенобиотиков в микросомах семенных пузырьков барана может осуществлять только в том случае, если в инкубационную среду вносят арахидоновую кислоту или простагландины. Следовательно, вначале происходит окисление арахидоновой кислоты до метаболита, который может быть использован гемопротеинами в качестве источника активной формы кислорода. Как оказалось впоследствие такими метаболитами могут быть органические гидроперекиси (в каскаде арахидоновой кислоты это простагландин G2).

Органические гидроперекиси могут образовываться в результате взаимодействия веществ с озоном и Ю2, а также в реакциях одноэлектронного переноса и ферментативных реакциях [177]. Среди основных групп гидроперекисей обнаруженных в живых организмах следует назвать три: 1) производные полиненасыщенных жирных кислот (линолевая, метиллиноле- вая, глицериллинолевая, холистеринлинолевая, линоленовая- 9-ООН2-13-ООН, арахидоновая-5-ООН, nrG2, 15-ООН-ПГЕ,); 2) производные стероидов (холестерин-7(5-ООН и -25[3-ООН, прегненолон-17а-ООН, прогестерон -17а-ООН; 3) производные нуклеиновых кислот (переокисленная ДНК, тимин — ООН).

Следует добавить, что при моделировании тех или иных ферментных систем, катализирующих восстановление молекулярного кислорода очень часто используют гидроперекиси этила, трет-бутила или кумила.

Гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот образуются в организме, в основном, по двум различным механизмам (автоокисление и реакцией с Ю2). Отсюда различное соотношение продуктов перекисного окисления этих кислот (табл. 8.10).

Несмотря на свою высокую реакционную способность, гидроперекиси довольно устойчивы в среде, не содержащей ионы металлов переменной валентности. Например, 9-гидроксипе- роксид и 13-гидроксипероксид линоленовой кислоты стабильны при 22 °С в течение суток.

Однако, в большинстве случаев гидроперекиси в живых организмах подвергаются восстановлению и распаду [179]. В результате двухэлектронного переноса из гидроперекисей образуются соответствующие оксипроизводные. В этом случае в качестве источников водорода выступает глутатион. В общем,

Таблица 8.10

Соотношение моногидроперекисей ненасыщенных жирных кислот в различных реакциях их образования [178]

bgcolor=white>изомеров
Жирная А доокисление Реакция с !0 2
кислота Положение Положение Соотно- Положение Положение Соотно
ООН двойной шение ООН двойной шение
группы связи изомеров группы связи
(%) (%)
9 10.
12
50 9 10, 12 53
18:2 13 9. 11 50 13 9. 11
(9, 12) 10

12

8, 12 9, 13 47
9 10, 12, 15 33,4 9 10. 12, 15
12 9, 13, 15 10,1 10 8. 12, 15 74
18:3 13 9, 11, 15 12,5 12 9, 13, 15
(9, 12, 15) 16 9, 12, 14 43,9 13 9, 11, 15
15 9, 12, 16 8
16 9, 12, 14 18

таким способом осуществляется регуляция уровней гидроперекисей в клетке. Наибольшая информация о соокислении ксенобиотиков сосредоточена в работах, посвященных простаглан- динсинтетазному катализу. Известны две группы первичных простагландинов — серий Е и F, отличающихся друг от друга тем, что первые содержат кетогруппу, а вторые — гидроксильную группу при С—9 циклопентанового кольца. Каждая из серий включает по три простагландина: Е,, Е2, Е3, F)a, F2a и F3a. Остальные относятся ко вторичным, так как являются продуктами ферментативного или химического превращения первичных. Так, простагландины серии А образуются в результате дегидратации циклопентанового кольца простагландинов Е (ПГЕ), а серии В — из простагландинов А (ПГА) путем изомеризации двойной связи кольца.

Конечные продукты биосинтеза простагландинов неодинаковы в различных органах и тканях. Следует отметить, что ара- хидоновая кислота превращается только в ПГЕ2 и ШТ2р, эйко- затриеновая кислота — в ПГЕ, и ПГЕ1а, а эйкозапентаеновая — в ПГЕ3 и nrF3a.

Биосинтез ПГЕ2 и ШТ2а катализируется простагландинсин- тетазой [180]. Это мультиферментный комплекс, состоящий из циклооксигеназы, пероксидазы, редуктазы и изомеразы. В зависимости от органа и ткани простагландинсинтетаза может катализировать образование простациклина (ШХ}2) из которого не ферментативным путем синтезируется 6-оксо-ШТ|а, простагландин D2, а также тромбоксан А2, мгновенно превращающийся в тромбоксан В2.

При изучении молекулярной организации некоторых ферментов простагландинсинтетазы было показано, что для проявления активности, например пероксидазы и циклооксигеназы необходим гем. При этом циклооксигеназная активность (20:4 + 202 —*■ ПГ02) всегда ниже пероксидазной (ПГС2 + + АН2—► РПН2 +А + Н20).

Рассматривая обе реакции, некоторые авторы [183] считают, что in vivo ШХл2 не является свободным метаболитом, а остается связанным с ферментом в процессе всего каталитического цикла.

Активный фермент относится к мембранносвязанным, является гемогликопротеином с единственной полипептидной цепью и молекулярной массой 72 кД [181]. При инкубации фермента с ацетилсалициловой кислотой (аспирин) наблюдается потеря только циклооксигеназной активности. В этом случае ацетильный участок аспирина присоединяется к активному центру фермента, инактивируя его (рис. 8.2).

При расщеплении такого ацилированного комплекса проназой pH 8,3 в течение 16 час, при температуре 35 °С образуется N-ацетилсерин (III). Если же протеолиз вести при более низких значениях pH, с коротким периодом воздействия температуры то освобождается О-ацетилсерин (И). Об этом свидетельствует появление в этих условиях и N-фенилананин-О-ацетилсерина (IV).

Рис. 8.2. Ацетилирование циклооксигеназы аспирином

Определение аминокислотной последовательности одиннадцати аминокислот N-концевой части полипептида фермента свидетельствует о наличии в их составе неполярных производных (4-х остатков пролина). Гипотетическая схема расположения фермента в мембране и его частичная структура представлена на рис. 8.3 [181]. Следовательно, активный центр фермента не содержит ковалентных связей между гидроксильной группой серина и соответствующими группами гема.

Рис. 8.3. Схематическое расположение молекулы простагландинсинтетазы в мембранах микросом семенных пузырьков барана

Механизмы соокисления ксенобиотиков в простагландин- синтетазном катализе рассматриваются на примерах субстратов с различной структурой. Однако наиболее значительные успехи достигнуты в опытах, где были использованы полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и ароматические амины. Источником простагландинсинтетазы служили семенные пузырьки барана, легкие, кишечник, тромбоциты и другие органы и ткани экспериментальных животных.

Известно, что бенз(а)пирен в гепатоцитах образует следующие группы метаболитов: 1) фенольные производные (3-окси; 6-окси; 9-окси); 2) эпоксиды (7,8-эпокиси; 9,10-эпокиси; 4,5-эпокиси);

3) хиноны (1,6-; 3,6- и 6,12-); 4) дигидродиолы; 5) эпоксиды дигид- родиолов; 6) тетролы. Метаболиты 1—3 и 5 образуются в моно- оксигеназном, а 4 и 6 — в эпоксидгидролазном катализе.

Физико-химическими методами анализа установлено [182], что в семенных пузырьках барана бенз(а)пирен превращается в 1,6-, 3,6- и 6,12-хиноны. Исходя из общих принципов механизмов окислительных реакций ксенобиотиков [20] можно заключить, что между бенз(а)пиреном и хинонами существуют промежуточные соединения эпоксидной природы.

Если в качестве субстрата простагландинсинтетазы используют (±)-транс-7,8-диокси-7,8-дигидробенз(а)пирен, то он в основном превращается в метаболит — антитранс-бенз(а)пирен- 7,10(8,9-тетрол) и в меньшей степени — в другие три диола.

Выход метаболитов увеличивается при внесении в инкубационную среду арахидоновой кислоты, ПГС2 и Д-оксиперокси- 5,8,11,13-эйкозатетраеновой кислоты [182]. Метирапон и СО не ингибируют как в случае цитохрома Р450 эти процессы, а НАДФН не ускоряет их. В тоже время индометацин (ингибитор простагландинсинтетазы) замедляет реакцию на 50 % [183]. Аналогичное соокисление бенз(а)пирена осуществляется также в легких морских свинок и толстой кишке [184].

Не вдаваясь в подробности методических приемов, использованных рядом авторов для выяснения источника активной формы кислорода, внедряемого в субстраты, отметим, что ими могут быть только эндоперекиси простагландинов. Действительно, инкубирование бенз(а)пирена с микросомами семенных пузырьков барана в присутствии [180]-15-перокси-эйкоза- 5,8,11,13-тетраеновой кислоты показало [183], что радиоактивный материал включается в его метаболиты.

В целом соокисление ксенобиотиков в простагландинсинте- тазном катализе можно представить следующим образом:

пероксидаза

Арахидоновая кислота —► ПГ02 —► ПГН2

[О]—------

бенз(а)пирен метаболит

Установлено, что диолэпоксиды связываются с макромолекулами клетки и обладают высоким мутагенным действием [184]. Однако будучи неустойчивым продуктом они легко трансформируется в другие метаболиты в реакции метано- лиза при выделении из биологического материала (химический путь) или реакции гидролиза в клетке (биохимический путь).

Следует отметить, что в ряде органов и тканей экспериментальных животных соответствующие метаболиты бенз(а)пире- на образуются в реакциях монооксигеназного типа. Однако они отличаются от соединения образующегося в простагландинсин- тетазном катализе стереохимическими свойствами. Известно, что конформационная изомерия имеет большое значение для циклических соединений и конденсированных полициклических систем [19]. Заместители в этих молекулах могут находиться в двух основных состояниях: экваториальном (в плоскости кольца) и аксиальном (перпендикулярно плоскости).

Для сравнительного изучения закономерностей стереоизби- рательного эпоксидирования ПАУ простагландинсинтетазой и монооксигеназой [185] был использован 7,8-дигидробенз(а)пи- рен (V), который окисляется до (+)- и (—)-9,10-эпокси-7,8,9,10- тетрагидробенз(а)пирена (VI).

(+)VI V (-)VI

Простагландинсинтетаза микросом семенных пузырьков барана окисляет V. с выходом продуктов реакции (—)-VI. и (+)-VI. в соотношении 54:46. Для монооксигеназной реакции оно составляет 89:11 (интактные микросомы крыс), 62:38 (индуцированные фенобарбиталом) и 69:31 (индуцированные 3-ме- тилхолантреном).

Представленные результаты свидетельствуют о том, что для реакции эпоксидирования характерно избирательное (частичное) образование из субстрата продукта, содержащего центр асимметрии. Это один из четырех возможных случаев стереохи- мической специфичности действия ферментов при метаболизме ксенобиотиков. В данном случае для простагландинсинтетазы отсутствует стереохимическая специфичность действия.

Парацетамол (ацетаминофен) в организме человека и подопытных животных образует сульфат и глюкуронид. Значительная часть этого препарата окисляется монооксигеназами с образованием N-оксипарацетамола, который, будучи нестабильным промежуточным соединением, превращается в химически реакционноспособный имидохинон. Если в среде содержится эквимолярное количество глутатиона, имидохинон превращается в нетоксичный метаболит. В опытах на животных он обнаруживается в моче в виде производных меркаптуровой кислоты.

Микросомы семенных пузырьков барана и мозгового слоя почек кролика в присутствии арахидоновой кислоты катализируют соокисление парацетамола до электрофильного метаболита, который также образует конъюгат с восстановленным глутатионом [186]. В атмосфере азота скорость образования такого конъюгата снижалась на 80 %. Индометацин и антиоксиданты блокируют эту реакцию, а метирапон не оказывает

на нее существенного влияния. Образование конъюгата — ферментативный процесс, поскольку он зависит от концентрации микросомного белка в пробе.

Гидроперекись линолевой кислоты также способна инициировать метаболизм парацетамола. Однако скорость соокисле- ния субстрата значительно ниже, чем в случае использования арахидоновой кислоты. Ингибирующий эффект в этом случае оказывают только антиоксиданты.

В отличие от цитохром Р450-зависимых ферментов проста- гландинсинтетаза в качестве интермедиата не образует N-гидро- ксильного производного парацетамола. По-видимому, при этом каталитическом процессе образуются соответствующие радикалы, которые при взаимодействии с глутатионом превращаются в меркаптуровые кислоты.

В биохимии чужеродных веществ для установления механизмов окислительных реакций, молекулярной организации и свойств ферментных систем, катализирующих эти процессы, в качестве субстратов используют N-, О- и S-монометил, и диме- тилпроизводные. Монооксигеназы осуществляют N-деметили- рование этих субстратов с образованием в качестве промежуточного соединения карбиноламина. Конечными метаболитами этой реакции являются формальдегид и соответствующие N-деалкильные производные. Стехиометрия процессов позволяет регистрировать по образованию формальдегида активность ряда монооксигеназ.

Микросомы семенников барана в присутствии арахидоновой кислоты также окисляют производные монометил- и диметил- анилина. Индометацин ингибирует эти процессы. Установлено [187], что деметилирование названных субстратов простаглан- динсинтетазой происходит в аэробных условиях и в отличие от монооксигеназ не характеризуется строгой субстратной специфичностью. Формальдегид образуется в инкубационной среде через 10—20 с после внесения субстрата, и процесс, как правило, продолжается 4—5 мин. Оптимальная концентрация белка микросом в пробе составляет 1 мг.

Инициировать деметилирование веществ могут также 15-пер- оксиарахидоновая кислота, трет-гидроперекись бутила и перекись водорода, но ПГН2 и НАДФН в этом случае в инкубационной среде не требовалось. Аналогичные процессы обнаружены в легких морских свинок и мышей, а также в мозговом слое почек кролика.

Механизм N-деметилирования субстратов простагландин- синтетазой отличается от монооксигеназного. Однако он окончательно не выяснен. Предполагается, что промежуточным продуктом при таком процессе может быть катион-радикал, который после гидролиза превращается в формальдегид.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что во всех перечисленных реакциях соокисления простагландинсин- тетаза выступает в роли простагландинпероксидазы. Следовательно, этот фермент по своим каталитическим свойствам должен напоминать другие пероксидазы. В биохимии хорошо известны механизмы действия пероксидаз на некоторые амины и фенолы.

Для простагландинсинтетазы характерным является и со- окисление эндогенных субстратов: стероидов [188] и билирубина [189].

8.1.1.6.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004

Еще по теме ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ СООКИСЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ:

  1. ФЕРМЕНТЫ, КАТАЛИЗИРУЮЩИЕ РЕАКЦИИ КОНЪЮГАЦИИ ЛЕКАРСТВ С АМИНОКИСЛОТАМИ И ПЕПТИДАМИ
  2. Стандартизация лекарственных средств. Контрольно-разрешительная система обеспечения качества лекарственных средств
  3. 11.Лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечный тракт. I. Противоязвенные средства
  4. 12.Лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечный тракт. II. Средства, влияющие на моторику и секрецию
  5. 13.Лекарственные средства, специфически влияющие на почки: диуретики (мочегонные средства)
  6. Классификация лекарственных средств
  7. Критерии качества лекарственных средств
  8. Лекарственные средства
  9. Глава 3 ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА s-ЭЛЕМЕНТОВ
  10. Глава 4 ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА р-ЭЛЕМЕНТОВ
  11. Глава 6 РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
  12. Глава 7ГОМЕОПАТИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
  13. Глава 9 АЦИКЛИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
  14. Глава 10 КАРБОЦИКЛИЧЕСКИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
  15. Лекарственные средства, применяемые в неонатологии