<<
>>

КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450

Бурное развитие в последнее время молекулярной биологии и генетики позволило решить некоторые сложные вопросы обсуждаемой проблемы. Исходными критериями послужили общеизвестные биологические закономерности.

Прежде всего это касается того, что регуляторные механизмы клетки определяются, в конечном счете, генами и их продуктами. Внутри клетки происходит непрерывная транскрипция многих генов, хотя часть генома может не проявляться. К факторам, определяющим скорость синтеза ферментов на рибосомах и в цитоплазме, относятся как скорость транскрипции, так и скорость деградации молекул мРНК. Таким образом, гены контролируют определенные метаболические реакции, регулируя биосинтез ферментов. Это нашло отражение в утверждении «один ген — один фермент». Следовательно, биосинтез различных форм цитохрома Р450 должен находиться под генетическим контролем и они должны отличаться друг от друга только аминокислотной последовательностью. Одни из них могут быть конститутивными, образующимися независимо от того, в каких условиях находится клетка, другие — индуцибельные, часто синтезирующиеся в следовых количествах и достигающие определенного уровня при наличии эндогенных или экзогенных субстратов. Для некоторых изоформ цитохрома Р450 наблюдается явление импринтинга, заключающееся в том, что после введения в пренатальном периоде индуктора (фенобарбитал) соответствующие значения гемопротеина в печени животных сохраняются и при достижении половой зрелости. В этом случае происходит необратимая индукция этих ферментов [135]. Следует отметить, что для некоторых конститутивных изоформ ферментов также наблюдается явление индукции, а для других оно отсутствует. Поэтому для изоформ цитохрома Р450 характерной особенностью является экспрессия генов. Транскрипционная активация отдельных генов начинается на различных стадиях развития организма и зависит от пола, вида животных и типа их тканей [136].

Несмотря на то, что процесс индукции цитохрома Р450 известен уже более сорока лет, его механизм установлен совсем недавно, благодаря широкомасштабным исследованиям CYP1A1. Оказалось, что для этой изоформы фермента индукторами являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они способны присоединяться к специфическому цитозольному ПАУ-рецептору (Ah) с последующим перемещением в ядро клетки (раздел 10.2.3). Последующий транскрипционный процесс включает стадии: 1) лиганд-зависимое взаимодействие (гетеродимеризация между Ah-рецептором и соответствующим ядерным переносчиком; 2) взаимодействие гетеродимера с ксе- нобиотик-чувствительным энхансером; 3) передача индуктивного сигнала от энхансера к промотору CYP1A4; 4) перестройка хроматиновых структур. Заканчивается процесс трансформацией мРНК и синтезом полипептидной цепи (трансляция) на матрице иРНК с участием рибосом и других компонентов бе- лок-синтезирующей системы [137].

Гормон роста, глюкокортикоиды и тиреоидные гормоны в значительной степени способны модулировать экспрессию генов [138].

Методами белковой химии (очистка ферментов, определение аминокислотного состава и др.), а также молекулярной биологи и (иммунохимические методы) в настоящее время установлено большое количество изоформ цитохрома Р450, а отсюда и их генов. Количество таких генов в настоящее время составляет около 500. Они обнаружены в 85 видах эукариот (беспозвоночные, позвоночные, растения, грибы) и 20 видах прокариот.

Благодаря рентгеноструктурному анализу, а также технике гомологического моделирования [139] было установлено строение А-, В-, F-, 7-субъединиц и трехмерное расположение активного центра многих представителей цитохрома Р450. Особое внимание при этом уделяется отдельной аминокислоте, например, Asp301 в CYP2D6, являющейся решающей в формировании активного центра фермента. Она участвует в образовани водородных связей с атомом азота субстратов (или ингибиторов).

Молекулярная масса гемопротеинов колеблется незначительно (CYP1A2 — 58 кД, CYP1B1 — 60 кД, CYP2B6 — 56 кД).

Белковая часть различных изоформ цитохрома Р450 отличается аминокислотным составом (CYP1A2 — 515 остатков, CYP1B1 — 543, CYP2B6 — 491), но все они имеют консервативный участок у концевой карбоксильной группы, содержащий 26 аминокислотных остатков.

Учитывая общность происхождения генов и принципы подобия аминокислотного состава белковой молекулы изоформ цитохрома Р450 было предложено использовать эту закономерность для их классификации [140].

Для обозначения цитохромов Р450 используют аббревиатуру CYP. Гены и продукты их экспрессии (мРНК, кДНК) также обозначаются CYP. Исключения составляют гены мышей и дрозофил (Сур). Все цитохромы Р450 называются суперсемейством, которое подразделяется на семейства. Сюда входят белки, которые имеют около 40 % подобия аминокислотного состава и обозначаются цифрой (1; 2; 3 и т. д.). Подсемейства — белки с подобием 65 %. Для их обозначения используют буквы латинского алфавита (А, В, С, и т. д.). Внутри подсемейства белки имеют сходство более чем на 65 % и это, как правило, индивидуальные ферменты (изоформы). Они обозначаются цифрой, стоящей после буквы (1А1; ЗВЗ; и т. д.). К настоящему моменту известно около 120 семейств цитохромов Р450 (табл. 8.2).

Такая классификация имеет ряд неудобств и трудностей. Это касается, например, тривиальных наименований генов, которые были открыты ранее, а позже была установлена их роль в кодировании цитохрома Р450.

Например, для Drosophila melanogaster и Arabidopsis thaliana определен ген Eig 17—1, который является не чем иным,, как сур 18. Следовательно, Сур становится официальным синонимом. Во многих публикациях использована старая номенклатура гемопротеинов, основанная на видовых особенностях («olf 1» и «II С 16» кодируются соответственно крысиными CYP2Y1 и кроличьими CYP2C16 генами). В банке данных также существует переход от старых наименований монооксигеназ,


Общая характеристика семейств цитохрома Р450 различных таксономических групп организмов

bgcolor=white>CYP15
CYP1 Позвоночные: индуцируются диоксином; метаболизм полициклических углеводородов, гетероциклических соединений, ароматических аминов
CYP2 Позвоночные и беспозвоночные: метаболизм лекарств и химических веществ окружающей среды
CYP3 Позвоночные: метаболизм лекарств и химических веществ окружающей среды
CYP4 Позвоночные: гидроксилирование жирных кислот; беспозвоночные: незвестные функции
CYP5 Позвоночные: тромбоксансинтаза Насекомые: метаболизм веществ растительного происхождения и пестицидов
CYP6 Насекомые: метаболизм веществ растительного происхождения и пестицидов
CYP7A Позвоночные: холестерин 7а-гидроксилаза
CYP7B Позвоночные: неизвестные функции
CYP8 Позвоночные: простациклинсинтаза
CYP9 Насекомые
CYP10 Моллюски (митохондриальные ферменты)
CYP11 Позвоночные: расщепление боковой цепи холестерина, стероид lip-гидроксилаза и альдостеронсинтаза (митохондрии)
CYP12 Насекомые (митохондриальные ферменты)
CYP13 Нематоды
CYP14 Нематоды
Насекомые
CYP16 Нематоды
CYP17 Позвоночные: стероид 17а-гидроксилаза
CYP18 Насекомые

CYP19 Позвоночные: ароматизация андрогенов
CYP21 Позвоночные: стероид 21- гидроксилаза
CYP24 Позвоночные: стероид 24-гидроксилаза (митохондрии)
CYP27 Позвоночные: стероид 27-гидроксилаза (митохондрии)
CYP51 Животные, грибы, дрожжи, растения, биосинтез стероидов
CYP52 Дрожжи: гидроксилирование алканов
CYP53—CYP62 Грибы
CYP71—CYP92 Растения
CYP73 Растения: гидроксилирование коричной кислоты
CYP101—CYP118 Бактерии

катализирующих гидроксилирование стероидов, на новую классификацию. Например, P450scc, Р45011Ы, Р45011Ь2, P450arom могут называться P450scc, Р450с11Ы, Р450с11Ь2, P450arom, но правильнее — CYP11B1, CYP11B2, CYP17 соответственно.

В настоящее время методы молекулярной биологии позволяют осуществлять различные манипуляции генетическими элементами. Они включают внедрение генов клонированием рекомбинантных молекул ДНК, сконструированных in vitro. Образующуюся при этом гибридную молекулу ДНК можно затем клонировать in vivo. Новая методология позволяет выделить индивидуальные фрагменты ДНК (гены) из любого источника в больших количествах. Благодаря таким находкам удалось получить изоформы цитохромов Р450, отличающиеся аминокислотной последовательностью от природных гемопротеинов. В данном случае рекомендовано использовать следующую номенклатуру. Вначале указывается природная изоформа цитохрома Р450, затем идет аббревиатура X###Y, где X — аминокислотная последовательность в его участке ###, a Y — замена в этом участке одной или более аминокислот на другие в рекоструированном (химерном) гемопротеине. Например,

CYP1A1I1426V свидетельствует о том, что в CYP1A1 в положении 426 изолейцин заменен валином.

Наличие столь разнообразной информации об изоформах цитохрома Р450 послужило основой для построения филогенетического дерева эволюции этих белков. Известно, что функционально те же самые ферменты из филогенетически удаленных видов сохраняют общие элементы структуры, но могут иметь существенно различающиеся последовательности. Однако существенным для таких белков является то, что они не имеют изменений аминокислотной последовательности в области активного центра. Вероятно, любое изменение на этом участке либо изменяет его стерическое соответствие и способность связывать субстрат, либо приводит к утрате той группы, которая принимает участие в каталитическом процессе. Следовательно, передачу признаков с модификацией можно легко оценить по дивергенции аминокислотной последовательности гомологичных белков, т. е. на основе вычисленного количества мутаций в кодонах. По-видимому, темп мутаций, проявляющийся в аминокислотной последовательности, меняется во времени и различен для разных семейств [141].

Существуют несколько схем, определяющих родство отдельных семейств цитохромов Р450 [142—144]. В наиболее распространенной и общепризнанной [140] основные семейства или отдельные изоформы разбиты на восемь (I—VIII) групп, которые последовательно связаны друг с другом. Основаны они на гомологиях в полипептидных цепях. К I группе (5 генов) относятся гемопротеины (четыре), присутствующие в организмах позвоночных животных, a CYP18 обнаружен только у насекомых. Группа II представлена кластером генов (13), встречающихся у растений. Группа III (6 генов) характерна для беспозвоночных животных. К группе IV (5 генов) относятся цитохромы Р450, катализирующие окисление жирных кислот в организмах прокариот и эукариот. Гены (семь) группы V кодируют митохондриальные цитохромы Р450, в большей части, обеспечивающие окисление стероидов. 4 Гена, объединенных в группу VI, относятся к растительным. 6 генов группы VII наблюдаются только у грибов. В группе VII (7 генов) объединены цитохромы Р450, находящиеся в различных таксономических группах. Интересно, что ген ароматазы млекопитающих CYP19 гомологичен CYP86A1, изолированной из Arabidopsis thaliana. Более того, обнаружено, что CYP51 (стероид 14-деме- тилаза) распространен среди животных, растений, грибов, дрожжей и является гомологичным гену CYP54, наблюдающегося у Neurospora. Очевидно, гены цитохрома Р450 от бактерий до человека имеют общего предшественника.

Следует отметить, что в такой филогенетической расстановке генов цитохрома Р450 не найдено места гену, кодирующему аналогичный фермент (CYP101), находящийся в Pseudomonas putida. Этот фермент выделен в кристаллическом виде и благодаря этому установлены каталитические свойства цитохрома Р450.

В данную схему также не включена NO-синтаза. По своей сути этот феремент напоминает цитохром Р450, то есть обладает аналогичной активностью. Тем не менее компьютерный анализ его аминокислотной последовательности показал, что он не является членом суперсемейства цитохрома Р450. Показано, что С-концевой домен NO-синтазы гомологичен семейству NADPH цитохром с редуктазы. Возможно, в процессе эволюции происходил и такой тип дивергенции белков, а отсюда и их функций.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что принципиальные черты структуры и функций цитохрома Р450 не претерпели существенных изменений за время дивергенции бактерий, растений и животных, которая происходила более 2 млрд, лет назад. В связи с этим одна из критических стадий эволюции — возникновение эффективного аэробного метаболизма, — почти наверняка имела место на ранних этапах развития. В это же время, очевидно, возникли и митохондрии, выполняющие важные функции клеток.

Наличие у определенного вида организмов своего набора хромосом делает актуальной задачу изучения локализации генов, кодирующих тот или иной белок (фермент). В этом плане имеются значительные успехи, касающиеся цитохромов Р450. Доказано, что CYP1A1 и CYP1A2 находятся близко друг от друга в хромосоме 15 человека. В случае, когда два или более гена находятся в кластере, рекомендовано указывать только принадлежность к семейству, т. е. «CYP1A кластер». У мышей Сур 1 а 1 и Сур1а2 локализованы в хромосоме 9 и также соответствуют Сур 1а кластеру. Для указания места локализации гена в хромосоме используется известная в молекулярной биологии и генетике аббревиатура: CYP1A 15q22-qter (MRI); CYPla Mid (Мрії). Установлены пять функциональных генов у CYP2D и аналогичное количество CYP2D (15-я хромосома). Кластер CYP2D (22q 13,1) человека представлен одним геном и двумя псевдогенами [145].

Предполагается, что 5 генов крысы, образующих CYP2D кластер, возникли в результате дупликации единичного гена, т. е. увеличения общего количества ДНК в геноме, происходившей в течение 400 млн. лет [140]. После такой дупликации диплоидные клетки имеют уже не 2, а 4 гена для каждого белка. В последующих генерациях каждая пара генов может изменяться независимо. В то время как одна пара генов продолжает направлять синтез исходного функционального белка, другая пара может претерпевать относительно большие мутационные изменения и становиться ответственной за синтез белка с той же функцией, но отличающегося по специфичности или активности.

В классических генетических исследованиях было показано, что часть одной хромосомы может быть перенесена (транслоци- рована) в другую хромосому. Очевидно, что аналогичные транслокации происходили и в ходе эволюции при дупликации генов цитохрома Р450. В результате таких процессов близкие гены оказались локализованными в различных хромосомах. Примером такой транслокации могут быть гены человека CYP2B (19gl3,1 — 13,2), CYP2C (19gl2—13,2) и CYP2D (10g24,1—24,3), образующие одно семейство. Наиболее древний ген CYP51 представлен соответствующим кластером у человека CYP51 (7-я хромосома) и двумя псевдогенами CYP51P1 (3-я хромосома) и CYP51P2 (13-я хромосома).

В токсикологических и фармакологических исследованиях в качестве экспериментальных животных наиболее часто используют различные линии крыс и мышей. Для них установлен изо- формный состав цитохрома Р450, основные представители которых представлены в табл. 8.3. Из нее следует, что только 3 изоформы семейства 1 (1А1, 1А2 и 1В1) и одна изоформа семейства 2 (2Е1) представлены ортологосными формами у человека и грызунов. Это означает, что названные изоформы локализованы во всех трех видах млекопитающих. Однако и для них характерна видовая специфичность. Так, CYP4501B1 человека эффективно катализирует О-деэтилирование этоксирезоруфина, в то время как аналогичная изоформа мышей абсолютно неактивна в этих реакциях. Отмечены значительные различия между CYP4501A2 человека, с одной стороны, мышиными и крысиными, с другой, по отношению к варфаринмонооксигеназной активности [20]. Очевидно, такая видовая специфичность ортологосных изоформ объясняется различием в их аминокислотном составе (табл. 8.3).

CYP450 Человек Крыса Мышь
1 (100), 2 (100) 1, (79), 2 (75) 1 (80), 2 (73)
і 1 1
6, 7, 13 1, 2, 3 4, 5, 12
6 1, 2, 3, 12, 15 9, 10, 13
8, 9, 18, 19 6, 7, И, 12, 13, 22, 23, 24 29
2D 6, 18 1, 2, 3, 4, 5 9, 10, 11, 12, 13
1 (100) 1 (80) 1 (77)
2F 1 2
2G 1
2J 2 3
ЗА 4, 5, 7 1, 2, 9, 18, 23 11, 13, 16
Таблица 8.3

Основные изоформы цитохрома Р450, катализирующие окисление


ксенобиотиков в организме человека, крысы и мыши

Примечание: в скобках — процент аминокислотного подобия изоформ CYP450, кодирующихся ортологосными генами

8.1.1.1.1.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450:

  1. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ ЛЕКАРСТВ
  2. ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ
  3. Классификация Vaughan-Williams
  4. Родственные классификации
  5. Классификация
  6. pTNM Патологоанатомическая классификация
  7. Классификация антиаритмических средств
  8. Резидуальные опухши (R Классификация)
  9. Правила классификации
  10. Классификация