<<
>>

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПРОЧНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ

При проведении молекулярно-биологических исследований в рамках LADMER постоянно возникает необходимость оценить прочность связывания малых и больших молекул. В настоящем разделе мы остановимся на общих положениях, касающихся этой проблемы. В каждом конкретном случае нами будут сделаны дополнения, которые характеризуют данный тип связывания (например рецепторы, ферменты) с последующим объяснением определенной специфики взаимодействия с лекарственными средствами.

Обратимся к уравнению 3.1, в котором показана способность молекул X связываться с молекулами Р.

Оценить количественно такую связь можно с помощью изменения концентраций X и Р и определяя как меняется при этом концентрация комплекса РХ.

Всегда величина этого изменения должна возрастать по мере увеличения концентрации X при сохранении концентрации молекул Р постоянной. Обычно молярная концентрация Р в опытах бывает мала, а концентрация X варьируют в весьма широких пределах. В этих условиях, при достаточно больших значениях [А], большая часть молекул Р переходит в РХ и изменение какого-то свойства (допустим ДА) перестает возрастать. Этот эффект, известный под названием насыщение, наблюдался в большинстве работ по исследованию процесса связывания, а также во многих физиологических процессах.

Свойство или изменение свойства, которое количественно характеризует (ДА), при насыщении (т. е. когда вещество Р переходит в РХ) достигает максимального значения — ДАтах. Отношение [РА] к суммарной концентрации всех форм Р, присутствующих в растворе [Р]поли, называется степенью насыщения и обозначается через у. Если молекула Р имеет более одного центра связывания для X, то величина характеризует

долю занятых центров от общего числа центров связывания. Если обозначить через п число центров связывания в расчете на одну молекулу, то общее число центров связывания будет равно п\Р\. Величину ~у часто принимают равной ДЛ/ДЛтах. Для макромолекул с несколькими центрами связывания это равенство соблюдается только при условии, что добавление каждой новой молекулы Л' приводит к одинаковому изменению А. Это условие выполняется не всегда, однако если оно выполняется, то должно выполняться и следующее соотношение:

у [РХ,] - АЛ

^п[Р}П0ЛН ДА™

Индекс і обозначает число лигандов Л', связанных с Р; он может меняться от 0 до п. При п = 1 степень насыщения у и величину ДЛ можно выразить через концентрацию несвязанного Л' и константу образования. Соответствующие соотношения имеют вид:

X/W . ДЛ-^аЛ/

1 + К,[Х\' 1 + /СД*]

На рис. 3.2 приведена кривая, характеризующая зависимость у (или ДЛ) от [Л'] для некоторой гипотетической реакции (эту кривую иногда называют изотермой адсорбции, поскольку для получения достоверных результатов эксперименты следует проводить при постоянной температуре). Из рис. 3.2 и уравнения 3.9 можно видеть, что когда величина [Л"] в точности равна 1 //С/ (или Ко), то ~у = 0,5. Видно также, что насыщение достигается медленно, и даже в точке, соответствующей наибольшей концентрации X(8/Kf), степень насыщения не превышает 90 %. Поскольку обычно в опытах измеряется ДЛ (а не £/), из кривой такого типа трудно определить предельное значение ДЛтах (за исключением случаев, когда величина К} очень велика). Однако для определения К/ необходимо знать именно ДЛтах. В связи

с этим графики, подобные представленному на рис.

3.2 используются редко, и он приведен нами здесь в основном для иллюстрации вводимых определений.

Рис. 3.2. Изотерма адсорбции — зависимость степени насыщения у (или изменение какого-нибудь свойства ДЛ) от концентрации вещества [ЛГ], обратимо связывающего с макромолекулой. Кривая носит гиперболический характер

при Ї/=0,5[Х]= 1 /К,

Кривая, изображенная на рис. 3.2 — это равнобочная гипербола в координатах {[X]; у}; поэтому кривые насыщения такого типа часто называют гиперболическими. Это название подчеркивает отличие изотермы адсорбции от кривых связывания несколько другого вида, которые в тех же координатах носят сигмоидный (S-образный) характер.

Зачастую более удобно строить графики в других координатах, а именно {lg[XJ; у} (рис. 3.3).

Перечислим причины, по которым эти координаты более удобны: 1) Кривая становится симметричной относительно средней точки, где lg[^] = — lgK/. 2) Независимо от того, насколько велик диапазон используемых концентраций X, всегда можно выбрать масштаб, при котором все точки уместятся на одном листе бумаги. 3) Расстояние между точками на кривой, построенной в указанных координатах {[X]; у} (сравните графики, приведенные на рис. 3.2 и 3.3, на которых экспериментальные точки соответствуют одним и тем же данным, причем каждое последующее

t

значение [X] в два раза больше предыдущего). 4) Логарифмическая шкала такого типа может быть использована для всех соединений, независимо от прочности связывания, и форма кривых для всех комплексов с соотношением компонентов 1:1 одинакова. Наклон кривой dy/d lg[A] в средней точке равен 0,576; изменение величины lg [X] при переходе от степени насыщения 10 % к степени насыщения 90% составляет 1,81. Аналогичные кривые хорошо знакомы химикам, поскольку они напоминают по форме кривые титрования, в которых вместо — lg[A] используется pH. При переходе от более слабого комплекса к более прочному кривая смещается влево, и наоборот. Кривые такого типа очень удобно описывать математически с помощью гиперболических функций.

Для графического представления данных по насыщению часто используют другую систему координат, известных под названием координат Скэтчарда (рис. 3.4).

При этом по одной оси откладывают величину ДАДА] (или у /\Х\, а по другой — ДА (или у), в результате чего точки ложатся на прямую. Из уравнения 3.10, непосредственно вытекающего из уравнения 3.9, следует, что отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс, и наклон прямой непосредственно дают значения ДАтак и К/.

у/[Х\ = К,-Щ, AA[X} = AAmmKl-AAKf,., (ЗЛО)

Все вышеизложенное отражает равновесие при участии одного связывающего центра, т. е. в уравнении 3.1 лиганд с белком связываются в отношении 1:1.

Если белок имеет несколько связывающих центров, как это чаще всего бывает в действительности, то соответствующее равновесие можно представить в следующем виде:

Р + Х^±РХ РХ + Х^РХ2

РХп_1 + Х^РХп

где п — количество эквивалентных и независимых связывающих центров в молекуле белка. Термодинамическое рассмотрение этой системы весьма сложно и здесь не будет описано. Предлагаем лишь конечный результат:

г . п[Х)

Kd+[X)

Величина г — равна отношению полной концентрации лиганда X, несвязанного с белком Р, к полной концентрации всех форм белка Р.

_ полная концентрация X, связанного с Р _ [РА] полная концентрация всех форм Р [Р] + [РА"]

Kd — среднее пропорциональное из всех констант диссоциации,

т.е. Kd = (Ku к2, .... кп)1/п.

Уравнение 3.11 можно преобразовать двумя способами к виду, удобному для обработки экспериментальных данных. Один их этих этапов:

Это равенство известно под названием Хью-Клотца. График зависимости \/г от \/[х] представляет собой прямую. Тангенс угла наклона равен Kjn, а пересечение с осью ординат дает 1 /п. Уравнение 3.11 можно переписать так же и в виде

г _ _п___ г_

М ~T~d~Td

График зависимости г/\х] от г также представляет собой прямую. Тангенс угла наклона равен — \/Kd, а точка пересечения с осью ординат дает n/Kd- В этой форме уравнение называется уравнением Скэтчарда.

Величины г и [А] можно определить многими методами, например равновесным диализом или спектроскопически (оптические спектры поглощения, флуоресценции, спектры магнитного резонанса). В заключение отметим, что многие белки имеют неэквивалентные связывающие центры, которые могут быть зависимыми или независимыми друг от друга. Это обстоятельство проявляется в том, что графики, построенные по уравнениям 3.12 и 3.13, оказываются не прямолинейными.

Рассмотрение равновесия такого типа достаточно сложное и включает так называемые микроскопические константы связывания [14].

3.3.

<< | >>
Источник: Головенко М. Я.. Фізико-хімічна фармакологія: Монографія. — Одеса: Астропринт,2004. —720 с.. 2004

Еще по теме КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПРОЧНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ:

  1. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ВСАСЫВАНИЯ ЛЕКАРСТВ
  2. 9.3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ЭЛИМИНАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
  3. СТЕРЕОСПЕЦИФИЧНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ С БЕЛКАМИ
  4. ПРИНЦИПЫ КОМПЛЕМЕНТАРНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ ЛЕКАРСТВ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МАКРОМОЛЕКУЛАМИ
  5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
  6. Количественные и качественные дефекты фагоцитов
  7. Технологический процесс оценки результатов лабораторных исследований, эффективного использования их в лечебно-диагностическом процессе и оценки влияния результатов анализов на улучшение качества оказания медицинской помощи пациентам, который состоит из следующих операций
  8. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ. ТАБЛИЦА 4. ТЕСТ-ОРГАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ
  9. Глава 3 Оценка специфической реактивности
  10. ДВЕ ОЦЕНКИ ДИСПЕРСИИ
  11. ВЫБОРОЧНЫЕ ОЦЕНКИ
  12. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ МАССОПЕРЕНОСА
  13. Оценка интервала QT
  14. Балльная оценка факторов риска
  15. Оценка дефицита магния