<<
>>

Механизмы активации ARE

Как отмечалось выше, на сегодняшний день известно более 20 регуляторных факто­ров, активность которых находится в зависимости от окислительно-восстановительного баланса в клетках. Изменение сигнальной активности этих факторов может происходить на стадии транскрипции, транслокации в ядре или на уровне связывания с промоторами.

Регуляторным г/моактивирующим элементом ARE в составе ДНК служит участок, со­держащий последовательность нуклеотидов 5'-AGTGACTnnnGCA/G-3' [232]; с ним свя­зывается ядерный фактор транскрипции Nrf2, относящийся к семейству NF-E2. Четыре представителя этого семейства р45, Nrfl, Nrf2 и Nrf3 были впервые описаны как факто­ры, активирующие мотив NF-E2/AP-1, находящийся в промоторе гена (3-глобина и опре­деляющий его экспрессию. ДНК-связывающий участок Nrf2 представляет собой домен лейциновой молнии bZip (basic region and leucine zipper), который отвечает за димериза­цию и связывание с сайтом ARE. В структурах типа лейциновой молнии каждая седьмая аминокислота является лейцином, они формируют гидрофобную область (домен bZip), позволяющую образовывать димеры. Структурные особенности bZip-домена Nrf2 тако­вы, что он не может образовывать гомодимеры, и поэтому для связывания Nrf2 с ARE необходимы вспомогательные белки-партнеры, содержащие подходящий bZip-домен. Из них наиболее изученными к настоящему времени являются белки семейства так назы­ваемых малых Maf-белков (musculoaponeurotic fibrosarcoma virus), MafF, MafG и MafK, которые принято разделять на большие Maf-белки, играющие важную роль в регуляции клеточной дифференцировки и эмбрионального развития, и малые Maf-белки, высту­пающие партнёрами к факторам транскрипции семейства CNC. Регуляторный участок ARE сходен с таковым для АР-1 (activating protein-1), 5'-TGACTCA, поэтому в индукции транскрипции контролируемых ARE генов могут принимать участие Jun-белки, такие как c-Jun, Jun-B, Jun-D, а также c-Fos [103, 227]. Кроме того, множество других факторов (ATF4, Frai, YABP, ARE-BP 1, Ah, hMAF) могут взаимодействовать с регионом ARE и тем самым усиливать или ингибировать транскрипцию регулируемых им генов [148, 226]. Промоторные участки некоторых генов, в частности НАД(Ф)Н:хиноноксидо- редуктазы 1 человека, содержат нуклеотидные последовательности 5'-TGACTCAGCA-3'. идентичные элементам TRE (5'-TGAG сТСА-3') и ARE, поэтому экспрессия таких генов может осуществляться через разные механизмы [231].

С позиции наиболее распространённой сегодня точки зрения считается, что посту­пающий в ядро фактор транскрипции Nrf2 формируют димеры с Maf-белками или Jun- белками, которые, связываясь с ARE, запускают транскрипцию соответствующих генов [75]. Исследования показывают, что все факторы семейства NF-E2 (р45. Nrfl, Nrf2 и Nrf3) могут формировать регуляторно активные димеры, однако выключение или ги­перпродукция каждого из них давали различные эффекты на уровне клетки или орга­низма [159, 193]. Nrfl, связываясь подобно Nrf2 с Jun-белками (c-Jun, Jun-B и Jun-D) или Maf-белками (MafG и MafK), может активировать транскрипцию генов ферментов II фазы детоксикации ксенобиотиков [103.

227]. Вместе с тем, по способности индуциро­вать экспрессию контролируемых ARE генов действие Nrfl отличалось от действия Nrf2 и было значительно менее эффективным [149]. Повышенная экспрессия Nrf3 в клетках HepG2 снижала базальную и индуцированную /и/7е/я-бутилгидрохиноном активность хиноноксидоредуктазы 1, что указывает на негативное действие Nrf3 в отношении ARE- регулируемых генов [193]. Отдельно комплексы c-Jun-c-Fos или c-Jun-Fral конкуриро­вали с Nrf2 за связывание с регуляторным участком ARE и ингибировали экспрессию контролируемых им генов [106, 226]. Предполагается также, что малые Maf-белки (MafG и MafK) способны формировать гомодимеры, которые, конкурентно маимодей- ствуя с ARB, могут ингибировать индуцирующее действие Nrf2 [50]. Эти взаимоотно­шения существенно усложняются наличием обратной регуляции; так, показано наличие ARE-активного участка для гена, кодирующего MafG. благодаря чему транскрипция mafG усиливалась под действием димерных комплексов MafG-Nrf2 [113].

В ответ на действие антиоксидантов и ксенобиотиков транскрипция гена nrf2 не из­меняется, что указывает на посттранскрипционную регуляцию активности Nrf2 [94]. Nrf2 человека имеет молекулярную массу 67 кДа и состоит из 605 а. к. о., которые обра­зуют 6 высококонсервативных доменов: Nehl-Neh6 (Nrf2-ECH homology; ECH - кури­ный аналог Nrf2) [99]. Nehl представляет собой bZip-домен, Neh2 - домен, негативно регулирующий функционирование Nrf2 посредством связывания с Keapl (Kelch-like ECH associating protein 1; гомологичный Kelch-белку дрозофилы протеин, связанный с актином цитоскелета); домены Neh4 и Neh5 опосредуют трансактивирующее действие Nrf2, связываясь с коактиватором транскрипции СВР/рЗОО (CREB binding protein; CREB - с AMP responsive element binding protein; рЗОО - гомолог СВР) [112]. Комплекс СВР/рЗОО обладает гистонацетилтрапсферазной активностью, а также привлекает до­полнительные гистонацетилтрансферазы. Кроме того, СРВ/рЗОО взаимодействует с ком­понентами комплекса РНК-полимеразы II, увеличивая концентрацию фермента в актив­ной зоне [251]. Ацетилирование гистонов делает структуру хроматина более открытой для взаимодействия с комплексом РНК-полимеразы II, повышенное содержание которой приводит к более частой инициации транскрипции в этом участке. Хотя Nrf2 связывает СВР/рЗОО с помощью двух трансактивируюших доменов, каждый из них способен свя­зывать коактиватор транскрипции по отдельности. Их одновременное присутствие в структуре Nrf2 усиливает способность друг друга взаимодействовать с СВР/рЗОО, т.е. связывание имеет кооперативный характер.

Для регуляторной системы Nrf2-Keapl позвоночных характерна высокая филогенетиче­ская консервативность, от рыб до млекопитающих, что подтверждает критическое значение защиты живых организмов от окислительного стресса и агрессивных электрофильных со­единений вне зависимости от их образа жизни, водного или наземного [120]. Формирование ядерных димерных комплексов Nrf2-MafK при индукции синтеза глутатион-S-трансферазы, сходных с комплексами в клетках млекопитающих, показано также у рыб [211 ].

В нормальном состоянии содержание №12 в ядрах клеток невелико, основная его часть связана с регуляторным белком Keapl на ядерной мембране или клеточном цитоскелете [99]. Как отмечалось выше, за связывание с Keapl отвечает №Ь2-домен, в котором выяв­ляется критический для связывания фрагмент из четырёх аминокислотных остатков -Glu- Thr-Gly-Glu- [120]. Мышиный полипептид Keapl с молекулярной массой 69,5 кДа со­держит 624 а. к. о., в том числе 25 остатков цистеина, которые, по всей видимости, и явля­ются сенсорами для широкого спектра соединений, индуцирующих диссоциацию ком­плекса №f2-Keapl [229]. Наиболее богат цистеиновыми остатками связывающий Nrf- белки фрагмент Keapl, на 102 аминокислоты которого их приходится 8. Четыре из них (Cys , Cys , Cys и Cys ) чувствительны к окислительной модификации и могут обра­зовывать дисульфидные связи [55]. Для Keapl из клеток человека были дополнительно выявлены 2 цистеиновых остатка, окисление которых приводило к диссоциации комплек­са Nrf2-Keapl [61]. Хотя состоящий из 597 а. к. о. мышиный Nrf2 (66,9 кДа) также содер­жит 7 остатков цистеина, которые более устойчивы к окислению и. по-видимому, не ока­зывают существенного влияния на диссоциацию комплекса №f2-Keapl, однако их со­стояние важно для взаимодействия №f2 с регуляторным участком ARE в составе ДНК [70]. Недавно показано, что в состав связывающего №12 центра Keapl могут входить ато­мы Zn. Рекомбинантный Keapl мыши содержал 0,9 атома Zn на субъединицу, при этом


катионы металла (Zn2+) взаимодействовали с активными атомами серы в составе цистеи­новых остатков, удаление атомов Zn приводило к диссоциации комплексов Nrf2-Keapl [56]. Таким образом, Nrf2-Keapl представляет собой редокс-чувствительный металлопро- теин, активность которого зависит от соотношения в среде окисленных и восстановленных тиолов (рис. 124). Глутатион, тиоредоксины и пероксиредоксины служат главными эле­ментами поддержания окислительно-восстановительного баланса тиолов в клетках, по­этому от активности этих систем зависит активность ARE.

Предполагается, что после диссоциации Nrf2 транспортируется в ядро, где формиру­ет димерные комплексы с низкомолекулярными Maf- или Jun-белками, которые связы­ваются с ARE и активируют транскрипцию контролируемых им генов [75]. Время суще­ствования свободного Nrf2 в клетках достаточно мало: Ту2 = 13 минут в Нера-клетках гепатомы мыши [206] и 15 минут - в НерС2-клетках человека [164]. Индукция экспрес­сии регулируемых ARE генов во многом зависит от высвобождения и стабильности фак­
тора транскрипции Nrf2. Ядерная концентрация Nrf2 и его стимулирующее действие возрастают в условиях ингибирования активности протеасом [105]. Низкомолекулярные природные тиолы (Ы-ацетил-Ь-цистеин и глутатион), аскорбиновая кислота, а- токоферол угнетают диссоциацию комплекса Nrf2-Keapl и снижают экспрессию кон­тролируемых ARE генов [13, 25, 217]. Кроме того, токоферолы (витамин Е), действуя через факторы транскрипции NF-кВ, АР-1, ретиноидный Х-рецептор и протеинкиназу С, способны индуцировать или подавлять экспрессию большого числа генов; предполага­ется, что хотя бы часть из этих генов регулируется через ARE [13].

Во многих исследованиях было показано, что в регуляции экспрессии контролируемых ARE генов принимают участие протеинкиназы: JNK1, МЕКК1 (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase 1_), TAK1 (TGF-(3-activated kinase !), ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase ]_), ERK2, PERK (pancreatic eIF-2a-related endoplasmic reticulum kinase), p38 и PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) [47, 110, 116, 122, 162, 245]. Предполагается, что киназы влияют на взаимодействие транскрипционного фактора Nrf2 с его цитоплазматическим ингибитором белком Keapl. Одной из главных киназ, вовлечен­ных в регуляцию ARE, является протеинкиназа С, которая фосфорилирует остаток серина (Ser40) в МеЬ2-фрагменте Nrf2, что приводит к диссоциации его комплекса с Keapl [24, 84]. Фосфорилирование Ser40 не влияло на транспорт Nrf2 в ядро и его связывание с регу­ляторным участком ДНК, однако повышало стабильность Nrf2 и время его существования в клетках [164]. Ингибиторы протеинкиназы С (калфостин С и стауроспорин) снижали индуцированный wpew-бутилгидрохиноном синтез НАД(Ф)Н:хиноноксидоредуктаза 1 в клетках HepG2 [24]. По структуре регуляторного домена изоформы протеинкиназ С мле­копитающих разделяются на три группы: классические, новые и атипические протеинки­назы. Предполагается, что в условиях окислительного стресса 4-гидрокси-2,3-ноненаль и форон (2,6-диметил-2,5 гептадиен-4-он) активируют атипическую протеинкиназу С. в ре­зультате чего снимается репрессия Nrf2 и стимулируется синтез гемоксигеназы-1 [167]. Индукция гемоксигеназы-1, тиоредоксина и пероксиредоксина 1 гемином в клетках ней­робластомы человека (SH-SY5Y) определялась активностью киназы PI3K [162]. В орга­низме протеинкиназа С и PI3K могут активировать Nrf2 и повышать синтез GSTA2 в гепа- тоцитах крыс посредством регуляции образования пероксинитрита [109, 116]. Широко распространённый растительный фенол куркумин увеличивал уровень гемоксигеназы-1 в эпителиальных клетках через активацию киназы р38 [15]. Индукция тяжёлой и лёгкой це­пей у-глутамилцистеинсинтетазы в клетках HepG2 снижалась при ингибировании киназ ERK и р38 [254]. Вместе с тем стимуляция синтеза фермента в эпителиоцитах из бронхов человека 4-гидрокси-2,3-ноненалем осуществлялась посредством активации АР-1 и JNK- киназы, но не зависела от киназ ERK и р38 [64]. Экспрессия АР-1 и индукция апоптоза куркумином в опухолевых клетках человека (НСТ116) определялись активацией JNK, но не зависели от р38- и ERK-киназы [45].

В основе кондиционной активации Nrf2 под действием протеинкиназ может лежать тот факт, что в цитоплазме Nrf2 быстро разрушается через убиквитин-зависимый путь. За деградацию Nrf2 посредством убиквитинирования отвечает МЕНб-домен. Фосфори­лирование Nrf2 протеинкиназой С или PERK-киназой ослабляет его взаимодействие с Keapl и ингибирует перенос убиквитина на Nrf2, что приводит к стабилизации послед­него в клетках [47, 164]. Тем самым Nrf2 приобретает возможность накапливаться в яд­ре, в то время как Keapl не изменяет своей внутриклеточной локализации и остается цитоплазматическим. Стоит отметить, что Nrf2 убиквитинируется и в условиях окисли­тельного стресса, но в этом случае время его полужизни существенно больше. Помимо активности протеинкиназ, для дерепрессии функций Nrf2 критически необходимым ока­зывается остаток цистеина в ВТВ-домене Keapl (Cys 151), точечная мутация которого делает Keapl конститутивным репрессором Nrf2. В условиях окислительного стресса к этому остатку ковалентно присоединяется множество разных высокомолекулярных со­единений, образующих устойчивые к действию восстановителей модификации Keapl.

Таким образом, в физиологических условиях in vivo Keapl действует как негативный регулятор ARE посредством связывания в цитоплазме Nrf2. Эта точка зрения подтвер­ждается экспериментами на животных, нокаутированных по гену keapl. Гомозиготные мыши с генотипом Keapl_/~ имели малый вес и погибали в первые 20 дней постнаталь­ного периода, у них наблюдался выраженный гиперкератоз пищевода и желудка [230]. В эмбриональных фибробластах КеарГ“-мышей наблюдалась высокая активность НАД(Ф)Н:хиноноксидоредуктазы, р- и я-глутатион-Б-трансфераз, на которую не влияло действие электрофилов, при этом клетки были устойчивы к индуцированному УФ- облучением апоптозу [81].

В живых организмах можно выделить два основных механизма регуляции редокс- чувствительных элементов: окисление/восстановление SH-содержащих аминокислотных остатков цистеина и метионина и окисление/восстановление атомов металлов перемен­ной валентности в металлопротеинах. Уникальной особенностью комплекса Nrf2-Keapl является совмещение этих механизмов. Действительно, окисление цистеиновых остат­ков Keapl, приводящее к диссоциации комплекса, - хорошо доказанный в исследовани­ях in vitro и in vivo факт, также как наличие редокс-чувствительных ионов Zn2+. По- видимому, такая сложная регуляция необходима для установления приоритетности по­ступающих в клетку сигналов. Внешние сигналы, передаваемые посредством гормонов, цитокинов, факторов роста, должны доминировать над естественным стремлением клет­ки сохранить свой статус и освободиться от токсического действия эндогенных и экзо­генных ксенобиотиков. В процессе морфогенеза или при воздействиях экстремальных факторов внешней среды индивидуальное стремление клетки к сохранению жизнеспо­собности и поддержанию внутреннего гомеостаза часто вступает в конфронтацию с эво- люционно сформировавшимися программами жизнедеятельности и адаптации много­клеточного организма. В частности, уровень Nrf2 в клетках определяет эффективность глутамат-индуцированного или опосредованного через Fas-рецепторы апоптоза [124, 158, 204], а индуктор апоптоза церамид одновременно ингибирует транскрипцию генов ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков [173]. Активация протеазами каспазы-3 при апоптозе в клетках HeLa и NIH3T3 сопровождалась деградацией Nrf2, более того, высвобождающийся при деградации ДНК-связывающий С-концевой участок Nrf2 был способен индуцировать апоптоз [169].

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Механизмы активации ARE:

  1. Активация лимфоцитов
  2. Активация протеаз
  3. Фактор активации тромбоцитов
  4. Фактор активации тромбоцитов
  5. Активация мембранного рецептора
  6. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ЛЕКАРСТВ
  7. ИНГИБИРОВАНИЕ, АКТИВАЦИЯ И ИНДУКЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
  8. Вторичные передатчики при активации лимфоцитов
  9. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ОБРАЗЦОВ МЕТАЛЛОВ НА ФУНКЦИЮ АКТИВАЦИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
  10. Механизм развития ДН