<<
>>

Методы регистрации Л/0# в биологических средах

Оксид азота является относительно долгоживущим радикалом, однако возможности применения простого ЭПР метода для регистрации NО* ограничены, с одной стороны, его низким содержанием в биологических средах (меньше нескольких нМ), с другой стороны, малым временем электронной релаксации [117]. В экспериментальных иссле­дованиях, когда возможно быстрое замораживание образцов, что повышает время жизни радикалов; метод ЭПР позволяет прямо регистрировать содержание N0* в различных тканях и биологических средах [656].

Однако часто такой подход невозможен, поэтому

значительно большее распространение получил ЭПР-метод с использованием спиновых ловушек. В качестве таких ловушек были предложены 2-метил-2-нитрозопропан, 3,5- дибром-4-нитрозобензол, гемоглобин [117, 121]; широко используются дериваты имида- золиноксил-1Ч-оксида [102] и дитиокарбаматов, насыщенных Ре2+ [569]. Применение в качестве спиновой ловушки М-метил-Л-глюкамин-дитиокарбамата, который вводится непосредственно в кровь животным, позволяет неинвазивно измерить образование N0* в крови т у1уо, при этом сигнал ЭПР регистрируется с хвоста мыши на специально скон­струированном спектрометре [569].

Связывание N0* с гемоглобином приводит к образованию нитрозилгемоглобина (НЬЖ)), время существования таких комплексов составляет от 40 мин (при 37 °С) до нескольких часов (при более низкой температуре) [228]. НЬЫО легко регистрируется методом ЭПР и позволяет оценивать содержание N0* в среде с пределом обнаружения 1 нМ [423]. Такой подход удобен для биологических и клинических исследований, так как с его помощью можно определять оксид азота непосредственно в образцах крови, что, в частности, было успешно показано при изучении механизмов действия нитроглицерина [228, 419]. Комплексы Ж)НЬ в образцах крови локализованы главным образом в эрит­роцитах; в некоторых патологических ситуациях (эндотоксический шок у крыс) до 0,8 % гемоглобина крови находится в связанном с N0* состоянии [1054].

Помимо ЭПР другим прямым методом регистрации ЫО-радикалов является хемилю­минесценция. Взаимодействие газообразного N0* с озоном приводит к образованию N02 в электронно-возбуждённом состоянии, релаксация которого в основное состояние сопровождается излучением кванта света [658, 763]:

ЫО + Оз >N024 02

N02* > N02 + 1ту.

Максимум интенсивности излучения лежит в области 660-900 нм [117]. Хемилюми­несцентный метод позволяет в водных растворах достичь предела регистрации N0* 10 13 М [1096], однако многие исследователи отмечают, что реально достижимый предел об­наружения - 20-50 пмоль [117, 196]. Поскольку N0* быстро окисляется с образованием нитратов и нитритов, хемилюминесцентное определение оксида азота в биологических жидкостях часто дополняют восстановлением последних: при комнатной температуре N0^ восстанавливают до N0* с помощью ванадия (III), измеряют вспышку свечения и после снижения хемилюминесценции до базовой линии повышают температуру до 90 °С, что приводит к ванадий-зависимому восстановлению N0' до N0* [973]. Содер­жание N0* в выдыхаемом воздухе определяют непрямыми методами по хемилюминес­ценции и газовой хроматографии-масс-спектрометрии, анализируя нитрозотиопролин, образующийся в реакции N0* с водным раствором тиопролина; в работе [620], решив проблему разделения N2 и N0*, предложили осуществлять прямое газово- хроматографическое-масс-спектрометрическое обнаружение оксида азота в выдыхаемом воздухе.

N0* - электрохимически активная молекула, которая легко окисляется на поверхно­сти металлического или угольного анода с образованием катиона нитрозония, в итоге

_0 + ОН” — н+

превращающегося в нитрит-анион: N0* > N0* > НСЖО >

N0 2; возникающий в результате ток прямо пропорционален концентрации оксида азота [973]. Описан высокочувствительный (предел обнаружения Ю"20 моль; диапазон линей­ных изменений от 10 нМ до 300 мкМ) электрохимический метод определения N0*, по-

Скорость NO-зависимого образования метгемоглобина определяют с помощью раз-7 личных спектрофотометрических методов. Наиболее чувствительна спектроскопия при двух длинах волны, 401 и 410 нм, предел обнаружения составляет 1 нмоль/л NO*; изме­нение содержания метгемоглобина (а следовательно и концентрацию оксида азота) вы­числяют ПО уравнению: ACmetHb = A(AA4oi_4lo)/Ae40|-410(metHb-oxyHb) [973]. In vivo судить об образовании NO* по уровню метгемоглобина в крови невозможно, поскольку последний быстро восстанавливается метгемоглобинредуктазой эритроцитов.

зволяющий с помощью микроэлектродов проводить измерения в отдельных клетках [647]. Показана высокая эффективность электрохимического порфиринового микросен­сора для обнаружения оксида азота в кровотоке человека in vivo [1010], однако в на­стоящее время такие датчики промышленностью не выпускаются. Кроме того, угольные электроды и порфириновые сенсоры также легко детектируют катехоламины (дофамин, норадреналин), поэтому в ситуациях, когда уровень катехоламинов предположительно повышен, измеренные электрохимически концентрации NO* нуждаются в верификации другими методами [973, 1010].

Продукцию NO* отдельными нейтрофилами также предложено измерять с помощью проточной цитометрии, используя флуоресценцию продуктов окисления дихлорофлуо- ресцина [434], а также продуктов взаимодействия NO* с так называемыми «флуорес­центными хелеотропными ловушками оксида азота» (FNOCTs) 95 % за 1 час) окисляется в N0 ~, поэтому не имеет смысла определять в плазме только содержание N0 2;

концентрация N0 2 и N0 ~ в образцах плазмы здоровых людей составляет соответст­венно от 1,3 до 13 мкмоль/л (в среднем 4,2 мкмоль/л) и от 4,0 до 45,3 (в среднем 19,7 мкмоль/л);

концентрации Ж)2 и N0” в плазме не коррелируют (содержание Ж)2 как процент от общего содержания N0 2 и N0 ~ варьирует от 3,9 % до 88 %);

образцы плазмы необходимо депротеинизировать и каждый образец сравнивать со своим контролем во избежание определения артефактно высоких концентраций N0 \ иШ~ [710];

нитриты и нитраты являются продуктом метаболизма микрофлоры кишечника;

возможно избыточное поступление нитратов с пищей [973].

На использовании свойства N0* окислять БН-содержащие соединения предложен спектрофотометрический метод его определения [252], основанный на измерении со­держания 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (к = 412 нм), продукта окисления тиоловых групп 5-тио-2-нитробензойной кислоты оксидом азота.

В биологических исследованиях используются также так называемые биологические методы определения N0*, основанные на способности оксида азота вызывать дозозави­симое расслабление гладкомышечных стенок сосудов [764, 763] или ингибировать агре­гацию тромбоцитов [867]. В таких исследованиях у животных выделяют небольшой уча­сток аорты в виде кольца, добавляют N0* и измеряют изменение диаметра сосуда [763]; отмытые тромбоциты помещают в агрегометр, добавляют источник N0* (фагоциты), а затем стимулируют их слипание тромбином и отслеживают снижение оптической плот­ности образца [867].

Субстратами ЫО-синтазы являются Ь-аргинин и НАДФН, конечным продуктом - Ь- цитруллин, поэтому возможно определение её активности по образованию меченого цитруллина из [3Н]-аргинина [1006] или [14С]-аргинина [476, 758], а также по увеличе­нию флуоресценции НАДО* (в этом случае активность ЫО-синтазы определяют по раз­нице НАДФ+-индуцированной флуоресценции в отсутствие и в присутствии Ь-ЫЫА) [1036]; идентификацией с активностью НАДФН-диафоразы [671]. При определении та­ким образом активности ЫО-синтазы в биологических образцах необходимо учитывать возможность рециклизации цитруллина в аргинин аргининосукцинатсинтазой и аргини- носукциназой, что может искусственно занижать результат; кроме того, в гомогенатах печени, в которой осуществляется полный цикл мочевины, может протекать превраще­ние цитруллина в орнитин.

Синглетный кислород

Изменение спина одного из электронов, находящихся на л*-орбиталях в молекуле ки­слорода, приводит к образованию возбуждённого синглетного состояния 'Ag (рис. 4), энергия которого на 96,3 кДж/М больше энергии основного триплетного состояния. Возможно также образование состояния 'Eg (энергия на 159,6 кДж/М выше энергии со­стояния 3Eg), когда электроны находятся на разных орбиталях, однако из него молекула кислорода в водных растворах переходит в состояние 'Ag за время около 10 12 с, поэтому практически зарегистрировать состояние 'Eg не удаётся [62, 446]. Время жизни !02 в насыщенном воздухом водном растворе составляет (3,15 ± 0,2) х 106 с, в этаноле - (13,0 ± 0,5) х 10'6 с, в дейтериевом буфере - 6,5 х10'5 с, в присутствии детергентов, образующих мицеллы, время жизни '02 увеличивалось в 1,5-2 раза [8, 532]. В отличие от жидкой фазы, в газообразной среде время жизни синглетных состояний существенно повышается. Было высказано предположение, что образующийся в атмосфере при фото- индуцированных процессах синглетный кислород в состоянии 'Eg может оказывать ци­тотоксическое действие на бактерии и микроорганизмы [770]. Однако специально про­веденная экспериментальная проверка с использованием генератора синглетного кисло­рода на основе фотосенсибилизации показала, что цитотоксическое действие связано с состоянием 1 Ag, время жизни которого в атмосфере - 0,047-0,092 с [688].

Синглетный кислород метастабилен, переход его в триплетное состояние сопровож­дается инфракрасной (1270 нм), а рекомбинация - красной (635 нм) люминесценцией [62, 84]. Благодаря своей высокой реакционной способности синглетный кислород легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, принимает участие в инициировании ПОЛ и возникновении биохемилюминесценции [24], в повреждении нуклеиновых кислот и канцерогенезе [330], ингибирует Са2+-АТФазу [584]. В модельных экспериментах с использованием гепатоцитов, клеточных линий чешуйчатой карциномы и базофильной лейкемии крысы показано прямое дозозависимое цитотоксическое дейст­вие экзогенного синглетного кислорода, при этом предполагаемой мишенью действия 102 являлись белки и полипептиды [283]. В наибольшей степени окислению синглетным кислородом подвержены тирозиновые остатки белков [1075]. Как показано на культуре человеческих фибробластов, под действием '02 повышается экспрессия мРНК интер­стициальной коллагеназы, в то же время синтез тканевого ингибитора металлопротеиназ не изменяется [883]. Это может быть причиной дисбаланса синтеза коллагеназы и её ингибитора, что наблюдается при УФ-облучении и развитии воспалительной реакции.

В экспериментах in vitro показано антитромботическое действие синглетного кисло­рода, которое проявляется, с одной стороны, в инактивации им тромбоцитов, фибрино­гена, факторов V, VIII и X, а с другой - в активации фибринолиза посредством супрес­

сии ингибитора активатора плазминогена-1, а2-антиплазмина и активации одноцепо­чечной урокиназы плазмином и окисленным фибрином [949]. Таким образом, через ге­нерацию *02 фагоциты могут усиливать фибринолиз, проникая в тромб и разрушая его, что особенно важно при атеротромбозе.

В живых организмах не выявлено специализированных механизмов наработки синг- летного кислорода, за исключением грибов вида Сегсоspora, которые для своей защиты синтезируют белок церкоспорин, вызывающий фотоиндуцированное образование Oj и !02 [615]. Вместе с тем во многих ферментативных реакциях (с участием СОД, каталазы, пероксидаз), а также в реакциях с АКМ и цитохромами, показано возникновение *02 (рис. 34) как сопутствующего продукта [220, 555, 565, 739, 968]. Так, в реакции разло­жения перекиси водорода каталазой 0,5 % образующегося кислорода возникает в синг- летном состоянии [84], при катализируемом гематином и цитохромом с разложении гид­роперекиси линолевой кислоты 20 мкМ перекиси дают 5,7 мкМ 102. В связи с низким выходом кислорода в синглетном состоянии и малым временем его жизни в биологиче­ских субстратах (24-130 нс в мембранах эритроцитов человека [532]) концентрация !02 в животных клетках не превышает 10'6 М [84, 220]. Малые значения времени жизни в кле­точных мембранах определяются взаимодействием 102 с антиоксидантами и белками, в то время как липиды дают только 2-7 % общего тушения [56, 532].

Сложности регистрации !02 затрудняют выявление его биологической роли, в част­ности, в микробицидном действии фагоцитов. Развитие дыхательного взрыва при сти­муляции фагоцитов сопровождается существенным усилением реакций диспропорцио­нирования радикалов О ~г (рис. 34, А) и галогенирования (рис. 34, Б), в которых синтези­руется синглетный кислород. Посредством измерения свечения в области 1268 нм было показано образование *02 в стимулированных ФМА эозинофилах, но не в нейтрофилах; с помощью хемилюминесценции обнаружено, что эозинофилы эффективно генерируют синглетный кислород в ответ на физиологические агонисты С5а и лейкотриен В4 [979]. Вместе с тем, основываясь на методе регистрации по окислению 9,10- дифенилантрацена, исследователи показали, что стимулированные ФМА нейтрофилы синтезируют 11,2 нмоль хО21\06 клеток [943], что составляет около 20 % от потребляе­мого клетками кислорода. В изящных экспериментах Хидетака Тацузавы с соавт. выяв­лено, что жизнеспособность трансформированных Е. coli, продуцирующих эффектив­ный ингибитор !02 каротеноид ликопин, в фаголизосомах нейтрофилов в 1,7 раза выше, чем бактерий дикого типа [976]; микробицидное действие синглетного кислорода авто­ры связывают с инактивацией им мембрансвязанных ферментов дыхательной цепи Е. coli [977]. Это позволяет рассматривать синглетный кислород как один из главных микробицидных агентов, действующих в области фагосом гранулоцитов [118, 943, 976].

Несмотря на то, что показано участие !02 в повреждении фагоцитами нуклеиновых кислот (индукция разрывов ДНК плазмид и бактериофагов [306]) и инициировании ПОЛ в мембранах, в общем цитотоксическом действии АКМ на клетки и ткани роль эндоген­ного '02, по-видимому, не является определяющей [548]. Значение !02 становится суще­ственным для различных фотоиндуцированных процессов, в частности - фотосенсиби­лизации. Энергии кванта света видимого диапазона (400-700 нм) недостаточно для раз­рыва С-Н-связей и образования радикалов, однако вполне достаточно для перевода молекулы кислорода в синглетное состояние, энергия которого на 96,3 кДж/моль выше энергии основного триплетного состояния. При фотосенсибилизации под действием све­та возникают возбуждённые триплетные состояния (3Р) молекул (сенсибилизаторов), энергия с них переносится на молекулярный кислород с образованием !02:


где Р, *Р и 3Р - основное, возбуждённое синглетное и триплетное состояния молекулы сенсибилизатора.

Рис. 34. Схема основных реакций, приводящих к образованию синглетного кислорода [21, 117]

А - реакции диспропорционирования

О 2 + О 2 + 2Н+ > Н202 + ^02

Н202 + Н202 > 2Н20 + '02

Б - реакции с участием миелопероксидазы (МПО)

Н202 + СГ —МП0 > Н20 + ОСГ

осг + Н202 > СГ + н2о + ‘о2

В - реакция разложения перекиси водорода каталазой

2Н202 ) 2Н20+‘02

Г - реакция Габера-Вейса О ~г + Н202 > ОН" + ОН’ + *02

Д - реакция гидроксильного радикала с супероксид-анионом о 2 + ОН' —> Н20 + ‘02

Под действием света, при наличии в среде эффективных сенсибилизаторов, синглет- ный кислород образуется в количестве, достаточном для проявления его цитотоксиче­ских свойств [62, 165]. Это явление лежит в основе фотодинамической терапии опухо­лей, при которой больному вводится сенсибилизатор (часто применяется фотофрин и его производные), после чего опухоль облучается интенсивным видимым светом, и образо­вание синглетного кислорода вызывает гибель опухолевых клеток [312. 670]. Помимо
цитотоксического действия на клетки в таких условиях ]02 способен активировать про­мотор вируса иммунодефицита человека [613], индуцировать выход простагландина Е2 [473] или некоторых цитокинов [312].

В растениях и фотосинтетических микроорганизмах молекулы хлорофилла являются эффективными фотогенераторами !02 [40], при этом in vitro квантовый выход образова­ния синглетного кислорода с растительными пигментами может достигать 65 %. Высо­кая эффективность образования синглетного кислорода позволила предложить произ­водные хлорофилла в качестве сенсибилизаторов для фотодинамической терапии [349].

Ингибиторами !02 в биологических системах являются фенольные антиоксиданты: токоферолы, убихиноны, а также аскорбат, белки и гистидин [40]. Однако в качестве наиболее эффективных тушителей выступают полиеновые углеводороды, и в первую очередь - ß-каротин, который взаимодействует с синглетным кислородом со скоростью 3 х 10ю М 'с 1, при этом одна молекула ß-каротина может инактивировать более 1000 молекул !02, прежде чем подвергнется окислительной деструкции [56]. Это можно объ­яснить тем, что ингибирование !02 идет по механизму переноса энергии на триплетный уровень ß-каротина, который лежит на 22 ккал/моль ниже уровня (!Д) состояния моле­кулы кислорода. Константы скорости взаимодействия !02 с липидами, белками, а-токоферолом и аскорбатом соответственно равны 105, 5 х 107, 108 и 4 х 107 М''с 1 [40].

Так как 102 - высокореакционная молекула, легко вступающая в окислительные ре­акции, то для регистрации 102 используются химические методы, основанные на реги­страции продуктов окисления синглетным кислородом олефинов, диенов, 2,5- диметилфурана и билирубина [984]. Данные методы неспецифичны (обычно реакции протекают и с другими формами АКМ: О ~2, ОН*, Н02*), а также недостаточно чувстви­тельны для обнаружения !02 в биологических системах, где его концентрация редко превышает 10'6 М. Поэтому химические методы определения синглетного кислорода применяются главным образом в специальных исследованиях, где нужно выявить факт его образования. Недавно разработан простой чувствительный метод регистрации '02, основанный на фотодинамической инактивации щелочной фосфатазы; в реакцию не вмешиваются ОН-радикалы и Н202 [1087].

В последние годы предложены "флуоресцентные красители, при взаимодействии с синглетным кислородом превращающиеся в интенсивно флуоресцирующие эпоксиды; на основании отсутствия взаимодействия красителя cOj, Н202 и NO* авторы предлага­ют использование данного метода для селективного определения !02 в биологических системах [1002]. В экспериментальных системах для измерения !02 применяются спек­тром етрыГретТГстрирующие собственную фосфоресценцию в области 1270 нм при фото сенсибилизированной генерации '02 наносекундными лазерными вспышками [8].

Для определения образования 102 в биологических образцах широко применяются биохемилюминесцентные методы, основанные на регистрации свечения в красной (634 нм) и инфракрасной (1270 нм) областях спектра [222, 533]^ Излучение квантов света происходит в реакциях дезактивации синглетного кислорода:

'02 > 02 + hv (1270 нм)

02 + 02 ^ 202 + hv (634 нм).

Смещение в красную область спектра излучения, возникающего в реакциях с синг­летным кислородом, позволяет легко дифференцировать его от излучения, возникающе­го в реакциях с алкоксильными и пероксильными радикалами, максимум которого ле­жит в области 350-500 нм. Таким образом, хемилюминесценция является эффективным

прямым методом регистрации синглетного кислорода в биологических и эксперимен­тальных системах [412, 552, 555]. Предложены также специфичные хемилюминесцент­ные методы опредёлВш5=а027' ОН* + СГ + 02,

однако такая реакция, по-видимому, не вносит дополнительный вклад в микробицидное действие гранулоцитов, а, скорее, снижает цитотоксичность, поскольку чрезвычайно бактерицидная гипохлорная кислота превращается в более реакционноспособный, но менее токсичный для бактерий ОН*: в силу малого радиуса действия ОН-радикала даже в ограниченном пространстве фагосомы более вероятно его взаимодействие с другими мишенями, нежели микроорганизмы [447].

Так как в условиях, близких к физиологическим, гипохлорная кислота находится в равновесии с ионом гипохлорита (НОС1 1тах = 460 нм) [924]. На принципе хемилюминесценции предложены простые методы определения наработки гипогалогенитов выделенными пероксидазами [80], суспензией гранулоцитов [15, 49] или в образцах цельной крови [29].

Алкоксильные и пероксильные радикалы

Как уже отмечалось, развитие цепных радикальных окислительных процессов сопро­вождается образованием перекисных (1Ю *) и алкоксильных (ЯО*) радикалов:

я* + о2 ->1*0* о)
1Ю* +1Ш > ЯООН + Я* (2)
ыоон э ЯО* + ОН* (3)

По физико-химическим свойствам алкоксильные и перекисные радикалы представ­ляют собой чрезвычайно гетерогенный класс соединений, включающий, с одной сторо­ны, высокореакционный ОН-радикал (время жизни в биологических субстратах 109 с), а с другой - малоактивные радикалы фенольных антиоксидантов, время жизни которых составляет от нескольких минут до нескольких часов.

Многие факторы физической и химической природы могут инициировать зарожде­ние органических радикалов в живых организмах, особо следует отметить следующие:

Образование радикалов может быть вызвано действием ионизирующих излучений, способных разрывать любые связи С-Н, С-С и О-Н; кванты света оптического диапазо­на (200 - 800 нм) также могут инициировать образование радикалов. Энергия разрыва С-Н-связей около 340 кДж/моль, поэтому фотоны ультрафиолетового диапазона с дли­ной волны меньше 300 нм (энергия больше 390 кДж/моль) способны разрывать связи С- Н и инициировать образование радикалов. Энергии квантов света видимого диапазона недостаточно для разрыва С-Н-связей, однако вполне достаточно для активации кисло­рода и перевода его в синглетное состояние, что требует всего лишь 96 кДж/моль энер­гии. Так как в электромагнитных взаимодействиях действует закон сохранения спина, то

прямой переход 02 ———> 102 невозможен. При наличии в среде сенсибилизаторов вначале происходит возбуждение молекулы сенсибилизатора в триплетное состояние (Сенс*), в последующем энергия передается на молекулярный кислород:

Сенс ———> Сенс*

Сенс* + 02 > Сенс + ]02

Хорошими сенсибилизаторами являются хлорофилл, гемоглобин, метиленовый голу­бой, родамин Б, эозин, некоторые соединения йода.

Эффективными инициаторами радикалообразования, особенно в клетках печени, могут выступать монооксигеназы, с этим связано токсичное действие галогенированных углеводородов, таких как тетрахлорметан и бромбензин. В клетках тетрахлорметан (СС14) метаболизируется монооксигеназной системой с образованием трихлорметильно- го радикала (СС13*), который быстро взаимодействует с молекулярным кислородом:

Cd* +02 >СС1302.

Трихлорметилпероксильный радикал (СС1302) способен разрывать С-Н-связи в ли­пидах с образованием липидных радикалов

R-H + СС130 * > R* + СС1302Н.

Активация процессов ПОЛ под действием галогенированных углеводородов является причиной развития токсических гепатитов.

Образование перекисных (R02) и алкоксильных радикалов (RO*) наблюдается также в реакциях разложения органических перекисей в присутствии ионов металлов переменной валентности (Cu2+, Со2+, Mn2+, V2+, Fe2+, Fe3+) или металлопротеинов [14, 565]:

ROOH + Меп+ > RO* + Ме(п+1)+ + Н20

Me(n+1)+ + ROOH + ОН’ > ROO* + Меп+ + Н20.

Взаимодействие RO 2 и RO* с углеводородами, приводящее к образованию ROH и ROOH, - как правило, наиболее медленная стадия развития цепных радикальных окис­лительных процессов, при этом фактором, определяющим константу скорости продол­жения цепи (RO 2 + RH > ROOH + R*), является прочность С-Н-связи. Для биологи­

ческих процессов ПОЛ скорость окисления находится в тесной зависимости от степени ненасыщенности липидов. Так, при окислении молекул с длиной цепочки 18-20 атомов и содержащих 1, 2, 3, 4, 5 или 6 двойных связей константы скорости окисления соотно­сятся как 0,025:1:2:4:6:8 [32]. Поэтому в биологических системах окислению в первую очередь подвергаются ненасыщенные липиды и жирные кислоты.

При свободнорадикальном окислении ненасыщенных жирных кислот образуются разные изомерные формы гидроперекисей, количество которых зависит от числа двой­ных связей (п) и равно (2п-2). Так, окисление линолевой кислоты [цепь из 18 атомов углерода с двумя двойными связями (18:2)] дает два соединения с гидропероксильной группой, связанной с 9 или 12 атомами углерода. В результате окисления линоленовой кислоты (18:3) (рис. 36) образуется 4 изомера моногидроперекисей; арахидоновой ки­слоты (20:4) - 6 изомеров; эйкозапентаеновой кислоты (20:5) - 8 изомеров; а докозагек- саеновая кислота (20:6) даёт 10 разных моногидроперекисей. В мембранах клеток жи­вотных в процессе ПОЛ образуются, по самым минимальным оценкам, более 100 разных липопероксидов [335].

Биологический эффект R02 и RO* реализуется как непосредственно, через их по­вреждающее действие на белки, ферменты, нуклеиновые кислоты [1063], так и через продукты ПОЛ - органические перекиси, альдегиды, кетоны, эпоксиды, некоторые из которых высокотоксичны для клеток [41, 269, 873]. Предполагается, что продукты ПОЛ мембранных структур клеток ингибируют синтез ДНК [327] и тем самым контролируют размножение клеток и рост организмов; участвуют в регулировании проницаемости и липидного состава мембран [41, 381]. Сывороточные липопротеины низкой плотности в результате их модификации гидроперекисями липидов становятся цитотоксичными и атерогенными [521], в то же время некоторые гидроперекиси холестерина ингибируют кальмодулин, вследствие чего снижается образование жировых полосок в аортах кроли­ков, содержащихся на атерогенной диете [988, 989].


Рис. 36. Схематическое изображение свободнорадикального окисления линоленовой кислоты и образующихся при окислении продуктов

Особый интерес у исследователей вызывают так называемые конечные продукты ПОЛ - альдегиды и кетоны, которые достаточно стабильны и долго существуют в орга­низме [337]. Низкомолекулярные альдегиды (2-алкенали, 4-гидроксиалкенали) сущест­венно влияют на функциональную активность фагоцитирующих клеток: ингибируют развитие дыхательного «взрыва» и продукцию О ~2 нейтрофилами [1073], фагоцитоз в моноцитах [845] и нейтрофилах [992], инактивируют глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу в клетках асцитной опухоли [967]; в низких пико- и микромолярных концентрациях обла­дают высокой хемотаксической активностью [281, 992], однако в концентрациях около 10'4 М (что характерно для воспалительного экссудата) ингибируют хемотаксис и хемо- кинез [281, 282]. 4-Гидроксиноненаль, основной водорастворимый продукт ПОЛ, акти­вирует фосфолипазу О в эндотелиальных клетках [725], ингибирует синтез простаглан- дина 12 и хемотаксис моноцитов [700], индуцирует синтез белков теплового шока [108], тромбоцитарного фактора роста [859] и коллагена [1098], усиливает пролиферацию гладкомышечных клеток [859]. Обладая широким спектром биологического действия, 4- гидроксиноненаль, по-видимому, является индуктором БОБ-ответа на окислительное повреждение [160].

Образование радикалов ЯО * и ЯО9 в биологических реакциях ПОЛ можно оцени- ватъ посредством измерения ЭПР-сигналов или собственной биохемилюминесценции [32, 138]. Метод ЭПР позволяет проводить количественные измерения содержания орга­нических радикалов в образцах и широко применяется для исследований в модельных системах. Сигнал ЭПР зависит от концентрации радикалов в образце, определяющейся, в свою очередь, скоростью их образования и временем жизни, которые, как правило, малы в биологических системах. С целью повышения чувствительности метода ЭПР предложены различные его модификации, такие как метод остановленной струи или замораживания и лиофилизации образцов. При использовании метода остановленной струи постоянно смешиваются высокие концентрации реагентов, образующих органиче­ские радикалы, за счёт чего увеличивается концентрация последних и усиливается сиг­нал ЭПР [14]. Быстрое замораживание или лиофилизация образцов позволяет увеличить время жизни радикалов и повысить добротность резонатора спектрометра, сниженную наличием молекул Н20 в жидкофазном состоянии. Данные приёмы не могут быть ис­пользованы в исследованиях на живых объектах; кроме того, в биологических образцах одновременно образуются различные радикалы, что приводит к наложению спектров ЭПР, затрудняет их идентификацию и количественные определения [32]; сама процеду­ра приготовления образца зачастую приводит к артефактному повышению генерации радикалов липидных гидроперекисей [137]. Поэтому, несмотря на то, что метод ЭПР фактически является единственным прямым количественным методом регистрации ор­ганических радикалов, он не нашёл широкого применения в биологических и клиниче­ских исследованиях.

Значительно большее распространение в изучении короткоживущих органических радикалов получил непрямой метод спиновых ловушек. Суть его заключается в регист­рации сигналов ЭПР не самих радикалов, а долгоживущих радикальных аддуктов, обра­зующихся в результате взаимодействия с определёнными соединениями - спиновыми ловушками. В качестве таких ловушек в биологических исследованиях широко приме­няются С-фенил-№-т/?ет-бутилнитрон, 5,5-диметилпирролин-1-оксид, трет- нитрозобутан и их многочисленные производные [30]. Предложены достаточно специ­фичные спиновые ловушки для радикалов О ~2, ОН*, N0* и др. Однако на пути развития и широкого применения метода спиновых ловушек лежат определённые трудности, одна из которых - низкая скорость взаимодействия молекулы ловушки с радикалом [14]. При этом чем более стабильный аддукт образует спиновая ловушка и чем более специфично её действие, тем меньше скорость её реагирования с окружающими молекулами, в том числе определяемым радикалом. Кроме того, спиновые аддукты нестабильны и часто подвергаются внутримолекулярной перестройке, что затрудняет идентификацию ради­калов.

В настоящее время наиболее чувствительным методом обнаружения алкоксильных и перекисных радикалов в биологических субстратах является регистрация интенсивности собственной биохемилюминесценции. Однако биохемилюминесцентный метод не вы­ступает в качестве прямого количественного метода определения концентрации радика­лов, а отражает достаточно сложный процесс излучения квантов света в результате де­зактивации электронновозбуждённых состояний молекул. В процессе образования кван­тов света выделяют несколько последовательных стадий: а) химические превращения исходных реагентов, в результате которых появляются возбуждённые молекулы - эмит­теры биохемилюминесценции; б) преобразования возбуждённого состояния; в) распад возбуждённого продукта с выделением кванта света [15, 24, 68]. В результате рекомби­нации перекисных радикалов образуется тетраоксид Н1ЮОО(ЖН, который в свою оче­редь распадается на кетон (Я=0), кислород и спирт:

НБЮО* + НЯОО* > НБЮООСЖН > Я=0 + 02 + Н1ЮН.

Разность энергий разорванных и вновь образованных связей в данной реакции около 400 кДж/моль, этого достаточно для образования электронновозбуждённых состояний карбонильных соединений (кетон или альдегид) и кислорода. Основными излучателями (эмиттерами) квантов света, как правило, являются кетоны в триплетном состоянии [24]:

(Я=0)* >{1=0 + 1™.

Излучение происходит в сине-зелёной области (350 + 500 нм), квантовый выход со­ставляет 10 8 + 106 на один акт рекомбинации перекисных радикалов [24, 68]. Энергия, достаточная для электронного возбуждения, выделяется при распаде диоксетана, обра­зующегося в реакции рекомбинации алкоксильных радикалов [24], а также продуктов рекомбинации других радикалов [32]. Биохемилюминесценция присуща всем клеткам и тканям живых организмов и, несмотря на неспецифичность метода, широко применяется в биологических и клинических исследованиях [15, 24, 67]. При этом биохемилюминес­ценция является удобным неинвазивным методом оценки ПОЛ посредством регистра­ции свечения с поверхности органов и тканей [94, 474, 698] или даже тела человека [25, 44, 996].

Собственное свечение клеток млекопитающих, а также сыворотки и гомогенатов тканей, имеет низкую интенсивность, обычно 100 + 1000 квант/сек/мл. Поэтому многие исследователи предлагают усиливать интенсивность свечения посредством введения в излучающую систему люминофоров - соединений с высоким квантовым выходом излу­чения. В этом случае регистрируются электронновозбуждённые состояния молекул, воз­никающие в реакциях рекомбинации перекисных и алкоксильных радикалов и перехо­дящие в основное состояние с излучением квантов света:

(Я=0)* + люминофор > Я=0 + люминофор*

люминофор* > люминофор + 1™.

В качестве таких люминофоров предложено использовать хлорофилл, излучающий в области 630 нм при взаимодействии с электронно-возбуждёнными карбонильными мо­лекулами [699], или люминесцентные красители - родамин Ж [83], эозин [66], бенгаль­ский розовый [719].

В цепные процессы ПОЛ постоянно вовлекается молекулярный кислород, при этом окисление ненасыщенных липидов приводит к уменьшению количества двойных связей в окисляемом субстрате. Поэтому косвенными методами оценки образования органиче­ских радикалов в биологических субстратах может являться полярографическое опреде­ление потребления кислорода [7, 34] или изменения количества двойных связей [38, 39]. Зависимость активности ПОЛ от концентрации кислорода имеет нелинейный характер с максимумом в области физиологических значений [984], при этом возможно вовлечение 02 в другие окислительные процессы 1804, 1015], а также развитие радикальных окисли­тельных реакций в бескислородной среде [573], поэтому нельзя однозначно связать по­требление 02 с активностью ПОЛ или образованием радикалов ЯО* и 1Ю * даже в про­стых экспериментальных системах.

В результате развития радикальных окислительных процессов в образующихся моле­кулах гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот появляются системы сопря­жённых двойных связей (-СН=СН-СН=СН-); отношение общего количества возникаю­щих гидроперекисей к числу молекул с двумя сопряжёнными двойными связями (дие­новых конъюгатов) составляет -2:1. Поэтому интегральным качественным показателем развития процессов ПОЛ в липидных структурах может служить определение содержа­ния диеновых конъюгатов [32, 37, 82]. Поглощение липидов в метанол-гептане зависит от наличия двойных и тройных сопряжённых связей: простые С-С-связи имеют макси­мум поглощения в области 203-220 нм; конъюгированные диены и кетодиены погло­щают в областях 232-236 нм и 272-280 нм, соответственно. Поэтому, измеряя оптиче­скую плотность липидных экстрактов при разных длинах волн, можно строить опреде­лённые умозаключения о степени их окисленности и, соответственно, о процессах, которые привели их к такому состоянию [37]. Метод определения диеновых конъюгатов нашёл достаточно широкое применение в клинических исследованиях, в то же время он является качественным и прямо не отражает наличия ни RO\ ни RO *,

Взаимодействие перекисных радикалов с липидами (преимущественно ненасыщен­ными) приводит к возникновению перекисных соединений: гидроперекисей ROOH, ди- алкилперекисей ROOR', пероксикислот RCOOOH, пероксиэфиров RCOOOR' и переки­сей других классов, образование которых можно регистрировать посредством УФ- или ИК-спектрофотометрии, методами хемилюминесценции [505] или ЯМР-спектроскопии, а также газовой и жидкостной хроматографии и их комбинации с масс-спектрометрией [32, 432], электрохимическим детектированием или хемилюминесценцией [570, 699]. При этом необходимо отметить высокую чувствительность хемилюминесцентных мето­дов, которые позволяют регистрировать 0,01 нМ гидроперекисей липидов Г1_621. 0,1 нмоль/мл третбутилгидроперекиси [505], 50 пМ гидроперекиси фосфатидилхолина [704], 0,3 пМ гидроперекиси линолевбТГКислоты 12631. Высокая чувствительность хеми­люминесцентных методов определения гидроперекисей липидов позволила измерить их содержание в нативных липопротеинах плазмы крови; липопротеинах низкой плотности человека оно составляет 45,20 ± 98,81 пмоль/мг белка [263].

Разработан флуориметрический метод оценки генерации липидных гидроперекисей и пероксирадикалов, основанный на использовании в качестве флуоресцентного зонда паринаровой кислоты [1012, 1013]; продукты взаимодействия этой полиненасыщенной жирной кислоты с RO * и ROOH не флуоресцируют. При анализе перекисных продуктов ПОЛ измеряется не интенсивность процесса свободнорадикального окисления и связан­ное с ним образование органических радикалов, а разность между скоростями генериро­вания и расходования определяемых соединений (рис. 36). Ввиду того, что перекиси являются довольно неустойчивыми соединениями, легко подвергающимися гомолити- ческому распаду, особенно в присутствии катализаторов (ионов металлов переменной валентности), а также интенсивному ферментативному расщеплению в системах in vivo, определение перекисных продуктов ПОЛ служит лишь косвенным свидетельством обра­зования пергидроксильных или алкоксильных радикалов.

Более устойчивыми, чем перекиси, продуктами развития радикальных процессов ПОЛ являются так называемые вторичные (конечные) соединения: спирты, альдегиды, кетоны, лактоны, предельные углеводороды и др. (рис. 36). Для обнаружения радикаль­ных окислительных процессов и оценки их активности существует много способов оп­ределения содержания в образцах отдельных альдегидов, кетонов или карбонильных групп [32, 785]. В клинических и биологических исследованиях широкое применение получил предложенный в 1944 году Коном и Ливерсейджем [567] колориметрический метод определения МДА в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), или МДА- метод (рис. 37). В данной реакции образуется окрашенный хромофор (максимум погло­
щения 532 нм), определяемый спектрофотометрически. При добавлении ТБК к субстра­ту, в котором протекают радикальные окислительные процессы, возникают окрашенные продукты, динамика образования которых во времени тесно коррелирует с поглощением 02 и отражает накопление МДА [1022]. Определение МДА в сыворотке [37, 785], моче [574, 883] или гомогенатах тканей [37, 314, 785] часто применяется в качестве инте­грального показателя активности процессов ПОЛ; отношение содержания МДА к кон­центрации холестерина предложено использовать как «фактор риска пероксидации ли­пидов» [79].

ОН

тиобарбитуровая

кислота

Рис. 37. Реакция, лежащая в основе МДА-метода определения активности процессов НОЛ

В основе широкого применения МДА-метода лежит простота его выполнения, одна­ко противовесом этому положительному качеству является высокая неспецифичность метода, особенно в приложении к биологическим субстратам, в которых возможна реак­ция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими сульфгидрильные и аминогруппы [32], поэтому в настоящее время при его использова­нии говорят об измерении концентрации не МДА, а «ТБК-реактивных продуктов» или «МДА-подобных соединений» [398]. Реакция с тиобарбитуровой кислотой в значитель­ной степени зависит от pH, температуры, наличия кислорода, антиоксидантов и ионов металлов переменной валентности, детергентов и других факторов [32, 507, 1009], по­этому при её постановке необходимы определённые методические ухищрения, особенно при изучении легко окисляющихся липидов, выделяемых из гомогенатов мозга [415]. Кроме того, показано образование МДА в ферментативных реакциях, в частности, при окислении арахидоновой кислоты по циклооксигеназномуjnyTn [286], а также окисление продуктов тиобарбитуровой кислоты с МДАв митохондриях и микросомах. В этой свя­зи некоторые исследователи ставят под сомнение ценность МДА-метода с тиобарбиту­ровой кислотой как индикатора активности процессов ПОЛ в гетерогенных биологиче­ских системах [32, 184].

В этой связи хочется процитировать признанных специалистов в области свободнора­дикальной биологии Джона М. С. Гаттериджа и Бэрри Холливелла [437]: «Метод ТБКР первоначально использовался в пищевой индустрии для контроля за прогорканием про­дуктов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. Просто нагрейте немного еды, биологической ткани или жидкости с 2-тиобарбитуровой кислотой в кислой среде, и полу­чите красивый розовый цвет - это может каждый! И каждый делает... Чтобы понять, что же на самом деле измеряется с помощью этого метода, свободнорадикальному сообществу потребовались десятки лет, и полного понимание пока нет... ГБК-тест имеет ценность при исследовании конкретных (defined) липидных систем (образцы пищи, микросомы и т.д.), но не может быть использован для сравнения ПОЛ гетерогенных систем с разным соста­вом полиненасыщенных жирных кислот ... и сам по себе не является достоверным показа­телем уровня ПОЛ в клетках, тканях или биологических жидкостях».

Более точным методом регистрации малонового диальдегида в биологических суб­стратах является его прямое определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии [495, 604]; считается, что определяемый таким способом МДА служит достоверным маркером интенсивности процессов ПОЛ.

Продукты ПОЛ достаточно легко мигрируют через клеточные мембраны, поэтому измерения содержания МДА и диеновых конъюгатов в плазме и клетках (эритроциты) крови человека дают близкие значения, кроме того, данные показатели являются инте­гральными и хорошо коррелируют друг с другом (коэффициент корреляции >0,9 [74]).

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006

Еще по теме Методы регистрации Л/0# в биологических средах:

  1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  2. Биологические методы
  3. Биологические методы
  4. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
  5. Дитрих Байерсдорфф. «Лечение и профилактика рака: комплексный подход»Традиционные, биологические и поддерживающие методы в современной онкологии0000, 0000
  6. Регистрация проб и заявок
  7. Глава 3 Регистрация, расследование поствакцинальных осложнений
  8. 45.9. Прием, регистрация, хранение и выдача трупов в судебно-медицинских моргах
  9. Порядок учета и регистрации ЗВУТ на предприятиях и в учреждениях
  10. 5.4. Государственная регистрация и лицензирование предпринимательства. Особенности предпринимательской деятельности в фармации