<<
>>

Методы регистрации супероксидного анион-радикала

Как уже отмечалось, в физиологических условиях Oj может выступать в роли как окислителя, так и восстановителя; это свойство восстанавливать органические соедине­ния позволяет дифференцировать наработку Oj и других форм АКМ.

Так, для регистра-^ ции синтеза Oj активированными фагоцитами [257, 512] или его образования в биохи-, мических реакциях [217, 370, 963] широко применяется реакция восстановления цито­хрома с, при которой феррицитохром с восстанавливается до ферроцитохрома с с изменением поглощения при 550 нм (О ~2 + Ее3+-цитохром с —> 02 + Ее2+-цитохром с; к = 5,8 х 105 M'V1 [482]). Коэффициент экстинкции для феррицитохрома с составляет 0,89 х 104 М^см'1, для ферроцитохрома с- 2,99 х 104 М^см'1, таким образом, ДЕт 550нм = 2,1 х 104 М^см'1 [ НСТ+в + о2

НСГ* + НСТ+’ > НСТ2+ + НСТ-Н+ или НСТ+* + 0*~ > НСТ-Н+ + 02.

Помимо нитросинего тетразолия, О 2 может восстанавливать другие соли тетразолия, в частности, йодонитротетразолий [796]. Данная реакция, аналогично НСТ-тесту, может использоваться для регистрации наработки супероксидного анион-радикала клетками или субклеточными структурами [134].

Простота выполнения НСТ-теста снискала ему популярность в биологических и кли­нических исследованиях [48, 77, 846]. Однако возможность применения НСТ-теста для исследований в клеточных суспензиях ставится под сомнение, так как показано незави­симое от О 2 восстановление нитросинего тетразолия донорами электронов НАДН и НАДФН в присутствии феназинметосульфата, НАДН-цитохром с-редуктазы, НАДФН- зависимых флавопротеинов [125, 889]; кроме того, при высоких значениях pH (около 10) нитросиний тетразолий эффективно восстанавливается фруктозамином, глюкозой, ас­корбиновой кислотой, глутатионом, мочевой кислотой, креатинином [65]. К артефакт- ному завышению результата может приводить и способность радикала НСТ** восстанав­ливать молекулярный кислород с образованием супероксид-аниона [973].

Г В последние годы количество исследований с применением НСТ-теста резко сокра- ) тилось, что связано с его низкой специфичностью и появлением более простых и чувст- /_ вительных хемилюминесцентных методов [29]. Разработаны сверхчувствительные мето­ды визуальной количественной оценки наработки О ~2 отдельными фагоцитами, осно­ванные на сочетании микроскопии и хемилюминесценции. Так, комбинация видеомикроскопа и камеры счёта фотонов позволила исследователям на основе анализа люминолзависимой хемилюминесценции установить, что стимулированные конканава- лином А нейтрофилы кролика в максимуме генерируют 1,9 фмоль/мин О ~2 на клетку [959].

Для регистрации О 2 разработаны хемилюминесцентные методы, в основе которых лежит измерение свечения, возникающего в реакциях супероксидного анион-радикала с люминофорами. В качестве таких люминофоров могут быть использованы: люминол [792] и его аналоги (изолюминол [642], 8-амино-5-хлоро-7-фенилпиридол[3,4- ^]пиридазин-1,4-(2Н,ЗН)дион [284]), люцигенин [522, 549], люциферины и их аналоги [797, ^61 ], фолазин (гликопрОТёин-связанный люцифёрйВ моллюска РНоЬб (1асгу1и8) [712, 829], СЬА и МСЬА (аналоги люциферина рачка СурпсИпа) [527, 718], целентеразин (люциферин кишечнополостных) [549, 641] и его аналоги [981]Прис.

24); при этом мо­дифицированные ЛЮМИНОЛ И ЛЮЦИ^ерИНьГвысокоспецифичны ДЛЯ О 2 и имеют высокий квантовый выход свечения [284, 748,^61]. В настоящее время хемилюминесцентные методы являются наиболее простыми и точными методами регистрации образования супероксидного анион-радикала в разных биологических системах.

Так как 02 является радикалом, в принципе его образование может быть измерено с помощью ЭПР, однако практически такой способ анализа мало приемлем в связи с не­большим значением времени жизни О ~2 [720] и его низкими концентрациями в биологи­ческих жидкостях, предельные концентрации обнаружения 02 простым ЭПР методом составляют около 10~8 М [987]. Чувствительность ЭПР позволяет повысить использова­ние различных спиновых ловушек, таких как гидроксиламин 1-гидрокси-2,2,6,6- тетраметил-4-оксопиперидин, который при окислении О 2 образует стабильный нитро- ксильный радикал 4-оксо-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксалата [12]; тайрон (4,5- диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия) [45, 61]; 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1 -

пирролин-Ы-оксид (ЭЕРМРО) [854].


Рис. 24. Люминофоры, применяемые для регистрации супероксидного анион-радикала

Помимо описанного выше цитохрома с, в определённых условиях используется од­ноэлектронный окислитель тетранитрометан, восстановление которого супероксид- анионом сопровождается изменением поглощения света при 350 нм (О 2 + С(М02)4 —> 02 +N0/ + ~С(М02)3; к = 2 х 109 М_1с~]). Несмотря на высокую эффективность взаимодейст­вия тетранитрометана сО^, его применение в биологических системах ограничено: так, при использовании соединения в ксантиноксидазной реакции количество регистрируе­мого супероксид-аниона завышается вследствие прямого восстановления тетранитроме­тана ксантиноксидазой [482]. Если исследователю удаётся повысить концентрацию су­
пероксидного анион-радикала, то последний может регистрироваться спектрофотомет­рически по поглощению в области 245 нм (коэффициент молярной экстинкции е = 2000 М'1) [14]. Предложены флуориметрические методы анализа О^, основанные на сниже­нии интенсивности флуоресценции 1,3-дифенилизобензофурана при взаимодействии с О 2 [744]; определении 4-метил-Р-Л-умбеллиферона, образующегося в реакции суперок­сидного аниона с 4-метил-Р-Б-умбеллиферил глюкопиранозидом [632]; а также на осно­ве окисления супероксид-анионом люминесцирующего в синей области спектра гидро- этидина (дигидроэтидина) до этидия, люминесцирующего в красной области спектра [5]. Последняя реакция в биологических системах может служить только для качественного, но не количественного определения продукции супероксид-аниона: возможно окисление гидроэтидина перекисью водорода, гипохлоритом, пероксинитритом, цитохромом с\ кроме того, флуорофор способен ускорять спонтанную дисмутацию О ~2 [161, 973]. На основе графитного микроэлектрода со стеклянной изоляцией разработан высокочувст­вительный амперометрический метод регистрации О ~2 в микрослоях среды у поверхно­сти одиночных клеток крови [972], это позволяет избежать применения химических реа­гентов, многие из которых обладают высокой токсичностью [681].

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Методы регистрации супероксидного анион-радикала:

  1. ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМ ОРГАНИЧЕСКИХ АНИОНОВ (ОАТ)
  2. Регистрация проб и заявок
  3. Глава 3 Регистрация, расследование поствакцинальных осложнений
  4. 45.9. Прием, регистрация, хранение и выдача трупов в судебно-медицинских моргах
  5. Порядок учета и регистрации ЗВУТ на предприятиях и в учреждениях
  6. 5.4. Государственная регистрация и лицензирование предпринимательства. Особенности предпринимательской деятельности в фармации
  7. Анкета здоровья спортсмена (система регистрации травм н истории болезни)
  8. Основные параклинические методы, используемые в системе медицинского обследования спортсменов. Электрофизиологические методы
  9. Традиційні методи контрацепції. Бар’єрні методи контрацепції
  10. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  11. НОВЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ: МИНИАТЮРИЗАЦИЯ И АВТОМАТИЗАЦИЯ
  12. Методи підготовки вагітних до родів. Медикаментозні методи підготовки вагітних до родів
  13. МЕТОД ЛАКТАЦІЙНОЇ АМЕНОРЕЇ
  14. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  15. Функциональные методы
  16. Природні методи контрацепції
  17. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  18. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  19. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  20. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ