<<
>>

НАДФН-оксидаза

Впервые связь метаболического («дыхательного», «окислительного») «взрыва», на­блюдаемого при стимуляции фагоцитирующих клеток, С продукцией О 2 мембрансвя- занной НАДФН-оксидазой была показана в 1973 году Бернардом М.

Бэбиором и др. / [130]. НАДФН-оксидаза (КФ 1.6.99.6, систематическое название НАДФН:(хинон- * акцептор)-оксидоредуктаза» фагоцитирующих клеток является ферментативным ком­плексом, специализированным на восстановлении молекулярного кислорода с образова­нием О 2 в реакции: НАДФН + 202 > НАДФ* + 20^ + Н+. До 90 % кислорода, по­

требляемого в процессе развития метаболического взрыва стимулированными нейтро­филами млекопитающих, может расходоваться на образование супероксидного аниона.

Компоненты НАДФН-оксидазы фагоцитов

НАДФН-оксидаза представляет собой сложную систему, состоящую из 6 гетероген­ных субъединиц, в том числе 2 мембрансвязанных (gp91phox, p22phox) и 4 цитозольных (p47phox, p40phox, p67phox, Racl/2) [218, 564, 730, 807, 897], которые при активации фермен­та под действием широкого спектра стимуляторов объединяются в ферментный ком­плекс, генерирующий супероксид-анион. Чтобы не допустить деструкцию собственной ткани организма хозяина («сопутствующего повреждения» [129]), энзиматическая ак­тивность НАДФН-оксидазы ограничена в пространстве (закрытое пространство фагосо- мы) и во времени (за счёт аутодеактивации фермента), при этом её регуляция осуществ­ляется с помощью двух основных механизмов: разделения субъединиц в покоящейся клетке по разным субклеточным компартментам (цитоплазма и мембраны) и модифика­ции белок-белковых и белок-липидных взаимодействий, посредством которой можно либо удерживать фермент в неактивном состоянии, либо индуцировать его самосборку.

/ Первоначально номенклатура компонентов сильно варьировала, и лишь в последние 5-10 лет, когда был сделан рывок в идентификации фрагментов НАДФН-оксидазы в I огромном количестве нефагоцитирующих клеток, классификация несколько упорядочи- ■ лась. Суффикс «phox», входящий в названия компонентов, является сокращением (phagocyte oxidase) и обозначает одновременно хронологию их открытия и высокую консервативность (как видовую, табл. 3, так и межклеточную); белки Racl/2 не имеют этого суффикса, будучи ГТФазами; gp91phox в последнее время по новой номенклатуре, принятой в июне 2001 г. на Гордоновской исследовательской конференции по фагоци­там, называют Nox2 (NADPH oxidase_2; в нефагоцитирующих клетках существуют ана­логичные компоненты No xi, Nox3, ~Iÿox4 и Nox5, см. ниже).


Идентичность белковых последовательностей компонентов НАДФН-оксидазы человека и других

видов животных (%) [807]

gP91phox p22phox P47ph0x P67phox P40phox
Человек 100 100 100 100 100
Бык 91,6 86,9 84,7 87,9 89,1
Бизон 91,8 85,7 84,2 88,1 89,4
Свинья 92,2 81,6 - - -
Кролик 91,4 81,5 83,6 77,6 89,7
Крыса - 88,8 - - -
Мышь 92,8 86,7 82,4 83,8 85,3
Дельфин 91,4 83,6 82,9 88,1 86,9

С генетически обусловленным отсутствием или дисфункцией основных компонентов НАДФН-оксидазы связано развитие редкого (1 : (200 000-250 000) новорожденных [1066]) наследственного заболевания - хронического гранулёматоза.

Патология начала выявляться в 50-х годах прошлого века, в 1957 г. получив название «детский фатальный хронический гранулёматоз» [164]. Исследования последующих лет позволили устано­вить, что функциональная активность гранулоцитов крови пациентов не изменена - не страдают ни фагоцитоз, ни хемотаксис, ни дегрануляция, и лишь в 1968 г. было обнару­жено, что ПЯЛ больных хроническим гранулёматозом не способны к развитию дыха­тельного «взрыва» [133]. На сегодняшний день показано, что развитие хронического гранулёматоза связано с дефектами генов, кодирующих p22pho\ gp91phox, p47phox, p67phox и (в единственном на сегодняшний день случае [115]) Rac2 (табл. 4) [617], заболевание проявляется снижением или полным отсутствием ферментативной активности НАДФН- оксидазы. При этом из выявленных в настоящее время 411 вариантов мутаций лишь 19 не сопровождаются снижением уровня кодируемого белка (хотя синтезируемый белок либо полностью неактивен, либо слабо активен, так называемые «мутации потери функ­ции»; 17 из 358 дефектов гена CYBB, 1 из 25 - CYBA, 1 из 17 - NCF2, 0 из 10 - NCF1, 0 из 1 - Rac2)\ в остальных 95 % случаев обусловливающие хронический гранулёматоз мутации приводят к полному отсутствию или резкому снижению экспрессии соответст­вующих субъединиц [478].

Патология характеризуется часто повторяющимися или персистентными нечувстви­тельными к антибиотикотерапии тяжёлыми пиогенными инфекциями, сопровождающи­мися гипергаммаглобулинемией, лимфоаденопатией и образованием обширных грану­лём в мягких тканях; последние состоят главным образом из буквально нафарширован­ных бактериями моноцитов/макрофагов и настолько велики, что могут вызывать обтурацию желудочно-кишечного и мочеполового трактов [478]. В качестве инфекцион­ного начала выступают каталазо-позитивные микроорганизмы - S. aureus, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens, аспергиллии, нокардии, в то время как инфицирование ка­талазо-негативными бактериями, такими как Streptococcus pneumoniae, встречается ред­ко [617].

Свойства компонентов НАДФН-оксидазы и их дефекты при хроническом гранулёматозе

gP91ph0X p22phox P47ph0x P67phox P40phox Rac2
I Ген:
хромосомная локализация Хр21.1 16q24 7q 11.23 lq25 22q 13.1 22ql2.3- q 13.2
название CYBB CYBA NCFÎ NCF2 NCF4 Rac2
длина (тыс. пар оснований) 30 8,5 15 40 18 18
количество экзонов 13 6 11 16 10 7
І Количест во аминокислот 570 195 390 526 339 192
I Молекулярная масса (кДа) 65,3 21,0 44,7 59,8 39,0 21 4[1]
Содержание:
нмоль/106 клеток 1,0-2,0 1,0-2,0 6,0 1,0 1,0 2,6
концентрация в цитоплазме

I (мМ)

2,75 0,46 0,46 1,2
| Хронический гранулёматоз:
I относительная частота встречаемости 65 % 5 % 25 % 5 % 0% 1 случай
I обозначение[2] Х91 А22 A47 A67

Примечание. * - к обозначению добавляется надстрочный символ «+», «-» или «О», соответственно указывающий на нормальный содержание субъединицы, сниженное либо полное отсутствие; ** - 46,9 кДа в комплексе с ЮтовО!.

Самым первым из компонентов НАДФН-оксидазы был открыт немитохондриальный цитохром Ь, содержащийся в фагоцитарных вакуолях гранулоцитов [895]; он получил название «цитохром Ь558», поскольку имел максимум поглощения (a-полосу) при 558- 559 нм, или «цитохром Ь_245» по необычно низкому стандартному восстановительному потенциалу -245 мВ. Вначале предполагалось, что это один белок, однако впоследствии выяснилось, что цитохром Ь558 представляет собой гетеродимер, состоящий из гликопро­теина с молекулярной массой 65,3 кДа ((3-субъединица) и негликозилированного белка с молекулярной массой ~21 кДа (а-субъединица) в стехиометрическом соотношении 1:1, в настоящее время имеющие соответствующие обозначения gp91phox_(glycoprotein of 91 kDa\ phagocyte oxidase-specific) и p22phox (protein of 22 kDa, phagocyte oxidase-specific) [807].

К-концевой участок компонента gp91phox (300 а. к. о.) содержит 6 трансмембранных а-спиральных участков и 3 участка гликозилирования, расположенных на второй (а. к. о. 120-167; А$п132 и А8п149) и третьей (а. к. о. 224-257; Азп240) внешних р-петлях, в со­став С-концевого участка входят места связывания ФАД и НАДФН (рис. 6). Ы-концевой фрагмент компонента р22рЬох образует по меньшей мере 2 [807] (возможно, 3 [427] или 4 [478]) трансмембранных а-спирали; цитоплазматический С-конец, не имеющий вторич­ной структуры, содержит полипролиновый мотив (участок связывания с БИЗ-доменами субъединицы р47рЬох, см. ниже) и фосфорилируемые в ходе активации НАДФН-оксидазы остатки треонина ТЬг132 и/или ТЬг147 (очевидно, также участвующие во взаимодейст­вии с р47р1юх) [427]. В состав цитохрома Ь558 входят 2 гема, каждый из которых связан двумя координационными связями с двумя остатками гистидина трансмембранных суб­доменов III и V субъединицы gp91phox (Н18101 :Н18209 и Шз115:Ш8222) таким образом, что тетрапиррольные структуры располагаются перпендикулярно плоскости мембраны [278, 896]. Существовавшее раньше предположение, что одна из гемовых групп распре­делена между gp91phox и остатком гистидина Н1б94 компонента р22р1юх [362], в настоящее время опровергнуто [171]. Гемовые группы расположены в толще мембраны по- разному: одна ближе к её внутренней поверхности, обращённой к цитоплазме, а другая - к внешней, обращённой к фагосоме. Поскольку толщина биологической мембраны в среднем составляет - 25 А, то для переноса электрона с цитозольных восстановительных эквивалентов НАДФН и ФАДН2 на внеклеточный 02 с кинетически значимыми скоро­стями необходимы по меньшей мере 2 редокс-участка [896]. Об этом свидетельствует и различие между гемами по стандартному восстановительному потенциалу (-225 мВ и - 265 мВ) [1021].

Рис. 6. Модель флавоцитохрома Ь558; I—VI и Н-1 - трансмембранные субдомены субъединиц gp91phox и р22р1юх соответственно, ромбы - гемовые группы; У - участки гликозилиро­вания, ФАД и НАДФН - участки связывания ФАД и НАДФН соответственно, Р - поли­пролиновый мотив [427, 807]

Первоначально считалось, что в состав НАДФН-оксидазы входят цитохром Ь и неиз­вестный флавопротеин, однако на сегодняшний день достоверно установлено, что ФАД- связывающим компонентом является сам цитохром Ь558, в связи с чем по современной номенклатуре он носит название «флавоцитохром Ь^х», или «флавоцитохром Ь»; ФАД связывается с компонентом gp91phox (а. к. о. 335-345 и 350-360) [478, 807]. На роль уча­стка связывания НАДФН исторически также были разные кандидаты, включая цито­зольные белки, в настоящее же время доказано, что НАДФН-связывающий участок со­держится в (3-субъединице [129, 427, 807]. В нестимулированных нейтрофилах человека 85 % флавоцитохрома Ь558 локализовано на мембранах специфических и желатиназных гранул и около 5 % - на цитоплазматической мембране, остальные 10 % связаны с так называемыми секреторными везикулами (особыми органеллами, предназначенными, как предполагается, для запасания связанных с цитоплазматической мембраной молекул) [564].

Таким образом, субъединица gp91phox флавоцитохрома Ь558 содержит все редокс- компоненты НАДФН-оксидазы, необходимые для трансмембранного переноса электро­нов на кислород и образования супероксидного анион-радикала. Каталитический цикл НАДФН-оксидазы протекает в несколько этапов. На первом этапе 2 электрона переда­ются с НАДФН на окисленный ФАД (рис. 7, А, 1) с образованием ФАДН2; в данном случае, как и во многих других биологических процессах, ФАД используется для пере­ключения двухэлектронного переноса на одноэлектронный. Кт флавоцитохрома Ь558 в составе цитоплазматической мембраны нейтрофилов в отношении НАДФН находится в пределах 25-35 мкМ, в то время как Кт для НАДН в 10-20 раз выше, и поскольку внут­риклеточные концентрации пиридиннуклеотидов приблизительно одинаковы и состав­ляют около 70 мкМ, в качестве донора гидрид-ионов НАДФН-оксидаза использует практически исключительно НАДФН [90, 278]. При этом такое значение Кт для НАДФН реализуется лишь в условиях закисления среды (pH ~ 6), что имеет место в фаголизосо- ме или очаге воспаления; при физиологических значениях pH (например, в системном кровотоке, где активация нейтрофилов не просто нежелательна, но и опасна), величина Кт резко увеличивается и составляет около 300 мкМ [90].

На втором этапе 1 электрон переносится с ФАДН2 на первую гемовую группу (рас­положенную ближе к цитоплазматической поверхности мембраны) с образованием се- михинона ФАДН* (рис. 7, А, 2), на третьем и четвёртом электрон передаётся соответст­венно на второй («внешний») гем (рис. 7, А, 3) и затем на кислород (рис. 7, А, 4); возни­кает первая молекула О ~г. Значение Кт фермента для кислорода по данным литературы варьирует, но в основном исследователи приводят цифры в пределах 5-10 мкМ [278]. Пятый, шестой и седьмой этапы повторяют соответственно второй, третий и четвёртый (образуется вторая молекула О^) с небольшим отличием - донором электрона на пятом

этапе служит не ФАДН2, а ФАДН* (рис. 7, А, 5). Необходимо отметить, что хотя в целом перенос электронов с НАДФН (Ет = -317 мВ) на 02 (Ет О^/Ог = -160 мВ) энергетически выгоден, на третьем и шестом этапах энергия понижается, поскольку стандартный вос­становительный потенциал «внутреннего» гема выше, чем «внешнего» (рис. 7, Б). Функциональное значение этого неожиданного элемента электронтранспортной цепи неизвестно, но его существование может отчасти объяснять необходимость наличия ки­слорода для быстрого переноса электронов через НАДФН-оксидазный комплекс, так как отсутствие 02, терминального акцептора электронов, должно приводить к накоплению их на «внутренней» гемовой группе.

5 Цитохром Ь 6 Цитохром Ь

X восстановленный\ X окисленный \/и2

-256 мвУ-225 мВ 1ёд-265 мВ 1 е Л-160 мВ

Цитохром Ь * ^

/ окисленный

ФАДН^

Цитохром Ь з Цитохром Ь 4д~

1е восстановленныйЧ X окисленный 2

-304 мВ д-225 мВ 1еУ-265 мВ 1еУ-160 мВ

Цитохром Ь * ^ Цитохром Ь х02

окисленный восстановленный


Молекулярная активность флавоцитохрома Ь558 по числу оборотов в отношении вос­становления кислорода составляет, по данным разных авторов, от 2000/мин [175] до 300/с [276].

Несмотря на то, что весь каталитический цикл НАДФН-оксидазы осуществляется субъединицей gp91phox, однако in vivo она не может функционировать сама по себе, не­зависимо от субъединицы p22phox и цитоплазматических кофакторов (компонентов НАДФН-оксидазного комплекса, описанных ниже), которые инициируют ферментатив­ную активность, способствуют транспорту электронов и, наконец, участвуют в деакти­вации энзима.

В число критических компонентов НАДФН-оксидазы, генетический дефект которых приводит к развитию хронического гранулёматоза, входят цитозольные белки p47ph0\

Г p67phox и p40phox. Субъединица p47phox (первоначальное название NCF1, «neutrophil ' cytosolic factor 1») служит как регуляторный и адапторный белок, облегчающий и уси­ливающий взаимодействие других компонентов НАДФН-оксидазного комплекса в 50- 100 раз [369]; благодаря этой своей способности p47pho\ также как и обнаруженный в нефагоцитирующих клетках аналог (см. ниже), на проходившей в ноябре 2002 г. в Цен­тре Бэнбери конференции по НАДФН-оксидазам получил название «организатор НАДФН-оксидазы» (NADPH oxidase organizer 2, Noxo2). В состав субъединицы p47phox входит несколько функционально значимых участков (рис. 8) [730, 807, 1021]:

^ • N-концевой домен РХ (j?hox homology), а. к. о. 4-125, участвует во взаимодействии НАДФН-оксидазного комплекса с фосфолипидами (преимущественно фосфатидили- нозитол-3,4-дифосфатами) мембраны и актином цитоскелета; впервые идентифици­рован в 1996 г. [786] как домен, присутствующий в субъединицах p47phox и p40phox;

два домена SH3 (Src homology 3 - пептидные последовательности, связывающиеся с короткими, до 10 а. к. о., консервативными полипролиновыми фрагментами), а. к. о, 163-211 и 227-281;

поликатионный участок, а. к. о. 314-347, содержащий большое количество остатков лизина и аргинина;

11 участков фосфорилирования (остатки серина 303, 304, 310, 315, 320, 328, 345, 348 359, 370 и 379); процесс фосфорилирования Ser359 и Ser370 является критическим для самосборки и каталитической активности НАДФН-оксидазного комплекса;

С-концевой полипролиновый домен, а. к. о. 360-371.

p67phox

р40р|""

В нестимулированном фагоците компонент р47р1юх существует как в свободной фор­ме, так и в виде трёхмерного комплекса с молекулярной массой 250-300 кДа, состояще­го из эквимолярных количеств р47р1юх, р67р1юх и р40рЬох (1:1:1) [600, 768], и в ходе акти­вации клетки перемещается на мембрану также как сам по себе [331], так и в составе комплекса [768].

В покоящейся клетке субъединица р47рЬох самоингибирована и имеет замкнутую конформацию, образованную путём внутримолекулярного взаимодействия двух БНЗ- доменов Ы-концевого участка с поликатионным фрагментом С-концевого региона и

N-концевым РХ-доменом (рис. 8). Стимуляция фагоцита сопровождается фосфорилиро­ванием компонента p47phox - ключевым моментом активации НАДФН-оксидазы - вызы­вающим конформационные изменения молекулы; в частности, фосфорилирование сери­новых остатков С-концевого участка p47phox демаскирует SH3-домены, что, с одной сто­роны, позволяет им взаимодействовать с полипролиновым участком мембранной субъединицы p22phox (рис. 6) [129, 600], а с другой стороны - открывает второй участок связывания с пролин-богатым регионом субъединицы p67phox (рис. 8). Ведущую роль в фосфорилировании играет протеинкиназа С (главным образом изоформы ß, 8 и Q, хотя показано участие в этом процессе и других киназ - митоген-активируемых (МАРК), ре­гулируемых внеклеточными сигналами (ERK), Akt, р21-активируемой (РАК), активи­руемой фосфатидной кислотой, казеинкиназой 2 [807]; варьирование киназ зависит, в частности, от характера стимулятора дыхательного «взрыва» и вида отвечающей на сти­мул фагоцитирующей клетки, и, вероятно, позволяет фагоцитам более гибко реагировать на условия активации.

Как и p47phox, субъединица p67phox первоначально была идентифицирована как отсут­ствующий у больных аутосомной рецессивной формой хронического гранулёматоза ци­тозольный фактор нейтрофилов (NCF2); белок абсолютно необходим для транспорта электронов через флавоцитохром b и принадлежит к семейству, названному семейством «активаторов НАДФН-оксидаз» (NADPH oxidase activator, Noxa) в ноябре 2002 г. на проходившей в центре Бэнбери конференции по НАДФН-оксидазам. Помимо p67phox, по этой номенклатуре обозначенного как Noxa2, к данному семейству белков отнесён со­держащийся в нефагоцитирующих клетках протеин Noxal (см. ниже). В состав субъеди­ницы p67phox входят [427, 807] (рис. 8):

4 N-концевых мотива TPR (tetratrico-peptide repeat; а. к. о. 6-154), опосредующих ГТФ-зависимое взаимодействие p67phox с цитоплазматическим компонентом Rac, а также связывающие НАДФН;

«домен активации» - участок между аминокислотными остатками 199 и 210, абсо­лютно необходимый для генерации О ~2, поскольку, очевидно, непосредственно взаи­модействует с флавоцитохромом Ь558 и участвует в переносе электронов [449];

полипролиновый участок (а. к. о. 219-231);

2 БНЗ-домена (а. к. о. соответственно 245-295 и 458-517), разделённых доменом РВ1 (Phox and Beml_, а. к. о. 351-429) - участком межбелковых взаимодействий, с помо­щью которого p47phox образует гетеродимер с РВ1-доменом субъединицы p40phox. Субъединица p67phox - лимитирующий компонент НАДФН-оксидазы; в цитоплазме

нейтрофилов её содержится в 2-3 раза меньше, чем p47phox [331], поэтому, очевидно, весь белок находится в связанном с p47phox состоянии. Так, в экспериментах in vitro было показано, что добавление экзогенной p67phox увеличивает связывание p47phox с цитоплаз­матической мембраной нейтрофилов при их последующей стимуляции, то есть субъеди­ница связывается со свободной p47phox) и повышается транслокация комплекса в мем­брану [1001]. Активация фагоцитов сопровождается, так же как и в случае с p47phox, фосфорилированием компонента p67phox, хотя и не столь интенсивным (фосфоэфирную связь образует единственный аминокислотный остаток, Thr233 [357]). Физиологическая роль процесса фосфорилирования в сборке и активации НАДФН-оксидазы не совсем ясна, тем не менее предполагается, что он способствует изменению конформации белка, регулируя внутримолекулярное взаимодействие между С-концевым участком и N- концевыми TPR-мотивами p67phox [807]; фосфорилирование осуществляют протеинкина­за С, р38 МАРК, ERK 1/2.

Субъединица p40phox наименее изучена по сравнению с другими цитозольными ком­понентами НАДФН-оксидазы; она содержит N-концевой РХ-домен (а. к. о. 24-143), один домен SH3 (а. к. о. 175-226) и С-концевой PB 1-домен (а. к. о. 283-310), ранее но­сивший название PC (phox and Çdc24) (рис. 8) [427, 807]. При активации фагоцита ком­понент p40phox, подобно другим цитозольным компонентам НАДФН-оксидазы, подвер­гается фосфорилированию (по а. к. о. Thrl54 и Ser315 [190]). РХ-домен субъединицы p40phox обладает сродством к фосфолипидам, однако, в отличие от РХ-домена p47phox, связывающегося преимущественно с фосфатидилинозитол-3,4-дифосфатами, предпочи­тает фосфатидилинозитол-3-фосфаты, тем самым имея другую мембранную специфич­ность и другой мишенный эффект (фосфатидилинозитол-3-фосфаты характерны для мембран фагосом) [427, 807]. РХ-фрагмент, по-видимому, участвует и во взаимодейст­вии субъединицы с цитоскелетом (с ним связывается N-концевой участок моэзина - белка, связанного с F-актином) [1060]; кроме того, показано взаимодействие компонента p40phox с цитоскелетом и через С-концевой участок, который связывается с актин- ассоциированным белком коронином [428].

Как указывалось выше, в покоящихся клетках p40phox входит в состав комплекса, об­разованного ещё двумя цитоплазматическими субъединицами НАДФН-оксидазы. Структура комплекса до конца не установлена; существуют 2 основные модели его ор­ганизации, по одной из которых p40phox служит адаптором, удерживающим вместе p67ph°x и p47phox, по другой же p67phox является «мостиком» между p40phox и p47phox, при этом две последние субъединицы не взаимодействуют друг с другом [600] (рис. 8). Вто­рая модель представляется более вероятной, так как недавно показано, что аффинность БНЗв-Домена p67phox к богатому пролином участку связывания компонента p47phox в 1000 раз выше, чем аффинность БНЗ-домена p40phox [600]. Взаимодействуя посредством РВ1- доменов, субъединицы p40phox и p67phox образуют чрезвычайно прочный комплекс (Kd = 10 нМ), при этом p67phox, по-видимому, стабилизирует субъединицу p40phox, выступая для неё в качестве шаперона; так, у больных хроническим гранулёматозом с генетиче­ским дефектом гена р67рЪох содержание компонента p40phox снижено или равно нулю: он синтезируется в нормальных количествах, но быстро разрушается из-за нестабильности молекулы в отсутствие p67phox [322].

Важную роль в активации НАДФН-оксидазы играют принадлежащие к Rho- семейству малых ГТФаз цитоплазматические белки Rac (RAS-related Ç3 botulinum to^in substrate) - повсеместно присутствующая изоформа Rjcj[ 13211 и экспрессируемая толь- ко гемопоэтическими клетками изоформа Rac2 [181, 427] (в нейтрофилах на Rac2 при­ходится более 96 % от всего содержания белков Rac [115]). Впервые участие ГТФаз ста­ло очевидным в конце 80-х годов XX в., когда была показана способность гуаниновых нуклеотидов стимулировать НАДФН-оксидазу. В настоящее время доказано, что при­сутствие Rac 1/2 абсолютно необходимо для полноценного функционирования фермент­ного комплекса [1053], хотя выявлен лишь единичный случай хронического гранулёма- тоза, обусловленный мутацией кодирующего Rac2 гена (замена гуанина на аденин в эк- зоне 3 кодона 8, приведшая к замене Asp57 на Asn57 в составе мотива DX2G, высококонсервативного для всех ГТФаз), что ведет к 2-3-кратному снижению экспрес­сии субъединицы Rac2 и активности НАДФН-оксидазы нейтрофилов [115]. Показано также, что нейтрофильные гранулоциты от нокаутированных по гену Rac2 мышей (гено­тип гас2“/~) в ответ на различные стимуляторы почти не синтезируют супероксид-анион [307].

В покоящейся клетке Rac2 связан с ингибитором диссоциации гуаниновых нуклеоти­дов, также принадлежащим к Rho-семейству (RhoGDI, guanine nucleotide dissociation inhibitor), и ГДФ. При активации фагоцита происходит диссоциация Rac2 и GDI, ГДФ заменяется гуанозинтрифосфатом с помощью факторов обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs, guanine nucleotide exchange factors), и Rac2, в активной ГТФ-связанной форме, перемещается на мембрану, где связывается с субъединицей p67phox [303]. Деактивация НАДФН-оксидазы сопровождается повышением присущей компоненту Rac2 ГТФазной активности, опосредованным активирующими ГТФазу белками (GAPs, GTPase activating proteifts), ГТФ гидролизируется до ГДФ, в результате чего субъединица переходит В *15- шстивную ГДФ-связанную форму и возвращается в цитоплазму [180, 427]. Конформаци- онные изменения, происходящие при переходе субъединицы Rac2 из неактивного со­стояния в активное и обратно, опосредованы двумя её регионами, носящими названия «переключатель I» (а. к. о. 30-40; «switch I»; другое название - «эффекторная петля») и «переключатель II» (а. к. о. 60-67; «switch II»); именно эти участки распознаются регу­ляторными белками RhoGDI, GEFs и GAPs [427]. К функционально важным участкам белка Rac относятся также так называемый «домен вставки», или «петля вставки» («insertion helix»; а. к. о. 123-135; присутствует только в ГТФазах Rho-семейства), и ги­первариабельный С-концевой участок, по которому в основном^ различаются Racl и Rac2. Обе изоформы пренилированы (геранил-геранилированы) по С-концевому участ­ку, что облегчает их взаимодействие с мембранами, однако в покоящейся клетке они находятся в цитоплазме, будучи связаны через регион «переключателя II» с RhoGDI, в особый гидрофобный карман которого погружена их С-концевая изопренильная группи­ровка [885]. Аминокислотные последовательности белков Racl и Rac2 гомологичны на 92 %, при этом участки обоих «переключателей» и «петли вставки» у изоформ идентич­ны [427].

Вопрос об участии субъединицы Rac2 в транспорте электрона с НАДФН на молеку­лярный кислород остаётся открытым. Существуют 3 основных модели, по одной из ко­торых предполагается, что p67phox - единственный из цитозольных компонентов, влияющий на ключевой момент переноса электрона с НАДФН на ФАД, a Rac2 служит лишь как адапторная молекула, связывающаяся, с одной стороны, своим пренилирован- ным С-концевым участком с фосфолипидами мембраны, а с другой стороны - с субъе­диницей p67phox и помогающая ей правильно ориентироваться (рис. 9, А) [109]. Сторон­ники второй модели считают, что Rac2 может с помощью «домена вставки» связываться с флавоцитохромом Ь558, но, как и для p47phox, это взаимодействие служит лишь для ори­ентации p67phox и облегчения комплексирования последнего с мембранными компонен­тами НАДФН-оксидазы (рис. 9, Б) [597]. По регуляторной модели Бэкки А. Дайболд и Гэри М. Бокоча предполагается, что на начальном этапе субъединица Rac2 действует независимо от p67phox, регулируя перенос электрона на ФАД, а в последующем, способ­ствуя транспорту электрона на 02, вступает с ней во взаимодействие (рис. 9, В) [302].


А "домен вставки" субъединицы Rac2 ^ "домен активации" субъединицы p67phox

изопренильная группировка субъединицы Rac2

Рис. 9. Предполагаемые модели регуляции НАДФН-оксидазы субъединицами Rac [180]

Помимо вышеописанных абсолютно необходимых цитоплазматических субъединиц, в состав полноценно функционирующего НАДФН-оксидазного комплекса входит белок RaplA. RaplA принадлежит к Ras-суперсемейству ГТФ-связывающих белков, имеет молекулярную массу 21,0 кДа и длину 184 а. к. о., кодирующий его ген у человека рас­положен в длинном плече хромосомы 1 (1р13.3). В покоящейся клетке субъединица RaplA локализуется в мембране секреторных везикул и специфических гранул, где свя­зана с флавоцитохромом Ь558 в соотношении 1:1, и при активации перемещается вместе с ним на цитоплазматическую мембрану [807, 1021]; RaplA нейтрофилов больных хрони­ческим гранулёматозом Х91 (вызванным дефектом компонента gp91phox) не теряют спо­собность активироваться и перемещаться в фаголизосому под действием стимуляторов дыхательного взрыва [1021]. При реконструировании НАДФН-оксидазы в бесклеточной системе in vitro RaplA не требуется, однако этот компонент, по-видимому, играет важ­ную регуляторную роль в интактных клетках: так, трансфекция в трансформированные вирусом Эпштейна-Барра В-лимфоциты [649] или клетки HL-60 [380] неактивных му­тантов RaplA (неспособных производить обмен ГДФ ГТФ) приводила к резкому па­дению способности клеток генерировать О 2 в ответ на форболовые эфиры. Показано, что фосфорилирование белка RaplA протеинкиназой А (по а. к. о. Seri80) приводит к снижению его способности связываться с с флавоцитохромом Ь558; поскольку известно, что данный фермент подавляет активность НАДФН-оксидазы, можно предположить функциональную значимость регулируемого протеинкиназой А, взаимодействия между флавоцитохромом Ь558 и RaplA [129].

При стимуляции фагоцитов происходит быстрая (индукция хемотаксическими пеп­тидами происходит в течение 2 с [135]) самосборка из мембранных и цитозольных ком­понентов НАДФН-оксидазного комплекса (рис. 10), осуществляющего трансмембран­ный перенос электрона с цитозольного НАДФН на внеклеточный молекулярный кисло­род с образованием Oj; в качестве стимуляторов выступает широкий спектр соединений корпускулярной и растворимой природы, действующих как через рецепторы, так и по рецептор-независимым механизмам.

Р47рІЮХ

р67рЬох

р40р1ю*


В ходе развития дыхательного взрыва pH в фагоцитарной вакуоли вначале повыша­ется до 7,8-8,0 (в первые 3 мин после начала фагоцитоза), а затем постепенно снижается приблизительно до 7,0 на 10-15-й минуте [897], соответственно первоначальное закис­ление цитоплазмы сменяется постепенным защелачиванием [508]. Такие изменения pH обусловлены тем, что процесс трансмембранного переноса электрона сопровождается миграцией в фагосому протонов посредством активации системы обмена Ыа+/Н+, Н+- АТФазы и пассивного переноса ионов Н+ через протонные каналы [508], а частичная нескомпенсированность pH объясняется одновременной транслокацией ионов К+ [101]. Природа протонных каналов является объектом дискуссии: некоторые исследователи считают, что они представляют собой отдельные, хотя и расположенные в непосредст­венной близости от НАДФН-оксидазы и модулируемые ею образования [295], другие утверждают, что субъединица gp91phox сама транспортирует ионы Н+ [665]. Согласно второй модели протонный канал образуется между трансмембранными доменами III и V |3-субъединицы в ходе активации НАДФН-оксидазы: гемовое железо переходит из высо-

коспинового гексакоординированного в низкоспиновое пентакоординированное состоя­ние, что повышает его аффинность к кислороду; в результате такого перехода освобож­дается аминокислотный остаток гистидина Ш8115 и увеличивается подвижность его имидазольного кольца, тем самым создаются благоприятные условия для транспорта ионов Н+ в этом участке мембраны и образуется чрезвычайно эффективная протонная пора [665].

Кроме того, параллельный транспорт протонов позволяет поддерживать стабиль­ность трансмембранного потенциала, поскольку массированный перенос электронов должен сопровождаться выраженной деполяризацией мембраны. Определённое измене­ние потенциала в ходе развития дыхательного взрыва происходит (от приблизительно - 70 мВ в покоящейся клетке до +58 мВ в стимулированной [295]), однако оно гораздо менее существенно, чем можно было бы ожидать исходя из активности ферментного комплекса. Так, в работах Энтони Сигала [278, 896] приведены следующие расчёты. При поглощении нейтрофилом частицы, размер которой сопоставим с размером бактерии, объём фагоцитарной вакуоли составляет около 0,2 мкм3, площадь её поверхности - 65 мкм2. В этом случае НАДФН-оксидаза потребляет 0,2 фмоль 02 и синтезирует 0,8-2,0 фмоль О 2, то есть через мембрану каждой вакуоли проходит 5-10 х 108 электронов, или

7 х 108 - через 1 мкм2 поверхности мембраны. Исходя из того, что заряд одного элек­трона составляет 1,6 х 1(Г19 кулонов, получается 4,6-11,7 х 1(Г3 кулонов/см2. Так как ёмкость мембраны равна приблизительно 1 микрофарад/см2, такой заряд должен был бы изменить потенциал мембраны на 4600-11700 вольт! Поскольку известно, что при депо­ляризации мембраны до +190 мВ работа НАДФН-оксидазы полностью прекращается, становится очевидной необходимость компенсации заряда для адекватного функциони­рования фермента.

Биологические эффекты синтезируемого НАДФН-оксидазой О;

Генерация О 2 при активации НАДФН-оксидазы фагоцитов играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действий. Так, супероксидный анион участвует в наработке хемотаксических пептидов [775, 778]. индуцирует синтез интерлейкин-1-подобного фактора [539], усиливает митоген- стимулированную пролиферацию лимфоцитов [16] и сам является митогеном [215], спо­собствует межлимфоцитарному распространению вируса иммунодефицита человека путём увеличения количества синцитиальных связей [528]. Взаимодействие с эндо- телиоцитами приводит к угнетению синтеза в них РНК и белка [519], подавлению ре- цептор-зависимого эндоцитоза липопротеинов низкой плотности (ЛНП) [792], ингиби­рованию эндотелиального фактора расслабления сосудов [152, 610] и, таким образом, к увеличению адгезии к ним циркулирующих гранулоцитов [404, 960]. В низких концен­трациях, когда в среде образуется 0,02 нмоль/мин О ~2, он стимулировал пролиферацию фибробластов в культуре, в высоких концентрациях, при скорости образовании 2 нмоль/мин, - напротив, ингибировал [715].

О 2 - малоактивный радикал и не влияет на функционирование большинства фер­ментов, хотя и может инактивировать некоторые из них: Са2+-АТФазу, 3-а- гидроксистероид-дегидрогеназу, каталазу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, па- паин, а,|3-дигидроксиизовалератдегидратазу, орнитиндекарбоксилазу, глутатионперок- сидазу, водород-НАД+-оксидоредуктазу из А1саИ§епез еШгоркт, креатинфосфокиназу [674, 963]. Будучи нуклеофильным соединением, О ~2 окисляет липопротеины сыворотки и фосфолипиды мембран [80, 178], что приводит к разрушению эритроцитов [1019, 1044], выходу лизосомальных ферментов [525] и образованию цитотоксинов. Повыше­ние соотношения НО 2/О * в липидной фазе [309] может быть причиной высокой ак­тивности О 2 в отношении окисления липидов мембран. Супероксидный анион-радикал может окислять гемоглобин (НЬ) в метгемоглобин (МеИЗЬ) и обратно восстанавливать его в гемоглобин [554]:

НЬ02 + О " + 2Н+ > МеШЪ + 02 + Н202

МеШЪ + о 2 —> нь + 02

Роль О 2 в реализации фагоцитами токсического действия в отношении клеток и микроорганизмов не вызывает сомнения [294, 371], ярким примером тому могут слу­жить гранулоциты, полученные от больных хроническим гранулёматозом, которые не могут восстанавливать кислород и вследствие этого обладают слабой микробицидной активностью [48]. В нейтрофилах больных с синдромом Дауна (трисомия по 21 хромо­соме) на 50 % повышено содержание Си^п-СОД, в результате чего у них снижена про­дукция О 2, а также микробицидная активность [116]. Вместе с тем молекулярные меха­низмы цитотоксичности О 2 неясны; более того, некоторые исследователи считают, что супероксид-анион не обладает непосредственной микробицидной активностью [218], а при воспалении служит пусковым звеном каскада реакций, приводящих к образованию других форм АКМ (рис. 11). В частности, дисмутация О ~2 приводит к наработке переки­си водорода, являющейся субстратом миелопероксидазы (см. ниже); в реакции Габера- Вейса (О 2 + Н202 > ОН" + ОН* + !02) образуются синглетный кислород и гидро­

ксильный радикал; взаимодействие О ~2 с оксидом азота (N0*) приводит к образованию реакционного пероксинитрита (ОЬЮО~). Кроме того, при низких pH, характерных для очага воспаления и внутренней среды фаголизосом, баланс НО ’ О 2 + Н+ сдвигает­ся в сторону более реакционноспособной протонированной формы [559]. Существует гипотеза, согласно которой генерируемый активированными НАД(Ф)Н-оксидазными комплексами супероксид-анион прежде всего служит как мембранный модулятор, изме­няющий физико-химические свойства фосфолипидного бислоя и тем самым облегчаю­щий другим биологически активным соединениям доступ к гидрофобной внутренней части мембраны, а также повышающий её вязкость [874]. При этом О 2, возникающий в ходе дыхательного «взрыва» фагоцитирующих микроорганизмы гранулоцитов, необхо­дим клеткам для быстрой перестройки мембраны и активного поглощения; непосредст­венно же микробицидной активностью обладает скорее НО *, нежели О 2.

Супероксидный радикал может как окислять, так и восстанавливать ионы железа и других металлов переменной валентности:

Ре3+ + О 2 Ре2+ + 02 Ре2+ + 2Н+ + О 2

Перекисное окисление липидов Пролиферация лимфоцитов Генерация хемотакоичеоких Факторов Высвобождение желе ROH + 02

RO J + О 2 + Н+ >R00H + 02

Хотя подавляющее большинство исследователей считает, что НАДФН-оксидаза уча­ствует в реализации микробицидного действия фагоцитов посредством восстановления молекулярного кислорода, данный вопрос нельзя считать окончательно решённым. В научной литературе высказываются предположения о возможности других механизмов микробицидного и цитотоксического действия мембрансвязанной оксидазы. Так, Энто­ни Сигал [897] считает, что к числу одной из важных функций НАДФН-оксидазы отно­сится транспорт электронов в фаголизосому, в результате чего происходят захват ионов Н+ и защелачивание среды, что в свою очередь приводит к активации нейтральных про­теаз, которые при низких pH в лизосомальных гранулах находятся в неактивном состоя­нии. Активация протеиназ и является ключевым элементом микробицидного действия, а оксидаза служит электронным насосом, запускающим данный процесс посредством из­менения pH от кислых значений (меньше 5,0) в лизосомах до нейтральных (около 7,8) в

фаголизосомах. При изучении окисления липопротеинов крови макрофагами нами также получены результаты [22], которые позволили предположить, что мембрансвязанный гемовый цитохром Ь558 может выступать в роли своеобразного реактива Фентона, инду­цирующего разложение органических перекисей с возникновением реакционных ради­калов. Поэтому, помимо образования О ~г, НАДФН-оксидаза может выполнять и другие важные для клеток функции.

Генерация Р~2 НАЦФН-оксидазами нефагоцитируюших клеток

По мере накопления знаний о структуре НАДФН-оксидазного комплекса гемопоэти­ческих клеток, особенностях его функционирования и роли в реализации микробицид- ного потенциала фагоцитов в 90-х годах XX в. явственно встал вопрос: является ли мем- брансвязанная НАДФН-оксидаза прерогативой фагоцитов или другие типы клеток также способны к развитию дыхательного «взрыва» и наработке О ~2 ?

Поскольку фагоциты обладают очень эффективным механизмом генерации АКМ, ко­торый необходим для реализации их цитотоксических потенций, логично было предпо­ложить, что такой же способностью генерации АКМ могут обладать естественные кил­леры (ЫК-клетки) [323]. Действительно, при взаимодействии с клетками-мишенями в ЫК-клетках повышается продукция АКМ, но этот эффект прямо не связан с их цитоток­сичностью; более того, анализ действия специфических ингибиторов показывает, что в этом случае образование АКМ происходит в реакциях окисления арахидоновой кислоты [323,471].

Тем не менее с течением времени накапливалось всё больше фактов, свидетельст­вующих о том, что развитие явления, имеющего многие признаки классического дыха­тельного взрыва (в том числе генерацию супероксид-аниона и происходящих из него АКМ), наблюдается и в нефагоцитирующих клетках:

при стимуляции В-лимфоцитов [607, 648];

при стимуляции Т-лимфоцитов [899];

в фибробластах в ответ на цитокины, ФМА, лейкотриен В4, опсонизированный зимо- зан, хемотаксический пептид ШЬР [514, 682], ангиотензин II [756];

в^эндотелиальных клетках в ответ на цитокины [664], брадикинин [485], ангиотензин II [1101], эндотелиальный фактор роста [1003], арахидоновую кислоту [687], фор- болмиристатацетат [411], при взаимодействии с кристаллами [338];

в гладкомышечных клетках артерий под действием липопротеинов низкой плотности [469, 757], ангиотензина II [756], тромбина, тромбоцитарного фактора роста, ФНО-а, лактозилцерамида [425];

в кардиомиоцитах крыс под действием гормонов и цитокинов: норадреналина [1082], эндотелина, фенилэфрина [971].

в клубочковых мезангиальных клетках почки [243, 809];

в тромбоцитах [655];

в хондроцитах быка под действием интерлейкина 1(3 [636].

Первоначально существовало предположение, что наработка АКМ эндотелиоцитами [849] и гладкомышечными клетками артерий [469] осуществляется при участии внутри­клеточного переносчика электронов, который под воздействием стимулятора восстанав­ливается, диффундирует через цитоплазматическую мембрану во внеклеточное про­странство, где и отдаёт электрон молекулярному кислороду с образованием в результате супероксид-аниона; в качестве переносчика электронов предполагались серосодержащие аминокислоты, в частности, Ь-цистеин [469]. Позднее было показано, что генерация

АКМ фибробластами, В-лимфоцитами и мезангиальными клетками человека обусловле- \ на работой электронтранспортной цепи, подобной НАДФН-оксидазе нейтрофилов и со­держащей низкопотенциальный цитохром Ь_245 и цитозольные""компоненты р47рЬох и р67рЬох [514, 648, 809]. При этом для В-лимфоцитов показана идентичность этих компо­нентов гранулоцитарным: иммуноблоттинг со специфическими антителами к компонен­там НАДФН-оксидазы нейтрофилов позволил выявить в В- (но не Т-лимфоцитах) 2 мембранных белка (91 и 22 кДа субъединицы цитохрома Ь558) и 2 цитозольных белка с молекулярными массами 47 и 65 кДа; их содержание составило 0,011, 0,026, 0,179 и 0,039, соответственно, относительно взятого за единицу содержания данных компонен­тов в нейтрофилах человека [563].

На основании анализа действия различных ингибиторов в эндотелиоцитах [1110], гладкомышечных клетках и адвентиции артерий [766] также была выявлена мембрансвя- занная ферментативная система, сходная по свойствам с НАДФН-оксидазой. При этом в эндотелиальных клетках с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрип­тазой показана экспрессия мРНК четырёх основных компонентов НАДФН-оксидазы лей­коцитарного типа ^р91рЬох, р22рЬох, р47рЬох, р67рЬох), а с использованием соответствующих антител - и белка этих субъединиц; активация клеток арахидоновой кислотой приводила к самосборке субъединиц и повышению генерации супероксид-аниона [687]. Интенсивность генерации АКМ эндотелиоцитами при стимуляции форболмиристатацетатом и эндотели­альным фактором роста была существенно ниже (около 1 %), чем полиморфноядерными лейкоцитами, что неудивительно, так как эндотелиальные клетки экспрессируют пример­но в ЦЩ)аз меньше белка gp91phox и р22рЬох, чем нейтрофилы [411, 1003]. Продукция О \ эндотелиоцитами сопровождалась быстрой (в течение 5 минут) активацией и транслока­цией малого в-белка Яас1 на цитоплазматическую мембрану [1003]. Было показано нали­чие всех четырёх основных компонентов НАДФН-оксидазы в кардиомиоцитах крыс, а именно gp91phox, р22рЬох, р47рЬох и р67рЬох, усиление продукции АКМ наблюдалось в ответ на активацию а}-адренергических рецепторов [1082].

} Какова же функция генерируемого электронпереносящей цепью нефагоцитирующих / клеток супероксид-аниона? Хотя структурно НАДФН-оксидазные системы немиелоидных / клеток чрезвычайно схожи с фагоцитарными (см. ниже), тем не менее они имеют принци­пиальные функциональные отличия - генерируемый ими в сравнительно небольших коли­чествах О 2 играет скорее регуляторную, сигнальную роль, нежели цитотоксическую. Так, в отличие от нейтрофилов, фибробласты высвобождают малые количества О ~г в течение нескольких часов, процесс регулируется Са2+/кальмодулином и не зависит от протеинки- назы С, тирозинкиназ, в-белков [682]; хотя оксидазы гладкомышечных клеток сосудов и эндотелиоцитов в качестве доноров электронов могут использовать НАДФН и НАДН, предпочтительным кофактором для них является НАДН [100, 425, 1004]; НАДФН- оксидаза фибробластов адвентиции конститутивно активна и не индуцируется классиче­ским симулятором гранулоцитов форболмиристатацетатом [756]. Кроме того, в отличие от фагоцитирующих клеток, синтезирующих О 2 с наружной стороны цитоплазматической мембраны, в область фагосомы, активация НАД(Ф)Н-оксидаз в эндотелиоцитах, гладко­мышечных клетках сосудов и кардиомиоцитах сопровождается внутриклеточным образо- к ванием О 2, служащим важным внутриклеточным регулятором [425].

Действие внешних стимуляторов приводит к активации НАД(Ф)Н-оксидаз и повы­шению цитоплазматической продукции супероксид-аниона, который либо прямо, либо через трансформацию в Н202 активирует киназные механизмы передачи сигналов. Такая

регуляция важна для контроля клеточной пролиферации, апоптоза, гипертрофии клеток сосудов и миокарда, ангиогенеза [542, 1003, 1004]; предполагается, что НАД(Ф)Н- оксидазные комплексы немиелоидных клеток могут служить в качестве универсальных датчиков кислорода, генерируя в ответ на гипоксию супероксид-анион и возникающие в результате его восстановления АКМ, способные влиять на тонус сосудов и воздухонос­ных путей, активность каротидных телец, экспрессию гена эритропоэтина [515]. Так,

В. П. Скулачёвым предложена схема двухступенчатой реакции воздухоносных путей и кровеносных сосудов на изменение р02 через посредство Н202-датчиков [73], в процессе участвуют 2 независимые белковые системы, локализованные в цитоплазматической мембране клеток нейроэпителиальных телец лёгкого и каротидных телец артерий: НАДФН-оксидаза и К+-канал, чувствительный к уровню перекиси водорода. При сни­жении концентрации 02 тормозится НАДФН-оксидазная реакция, падает содержание Н202 (продукта супероксиддисмутазной реакции), К+-канал закрывается, что ведёт к де­поляризации мембран, возбуждению клетки и выделению серотонина (нейроэпители­альные тельца) или катехоламинов (каротидные тельца), а следовательно - к расшире­нию соответственно воздухоносных путей или кровеносных сосудов.

Интересная гипотеза выдвинута в отношении лимфоцитов: предполагается, что О \ играет определённую роль в контроле роста и дифференцировки В-лимфоцитов [181, 648] и активации Т-лимфоцитов [828]. Существует также предположение об участии О ~2 в феномене соматической гипермутации В-лимфоцитов [181, 648], который характери­зуется взрывом замещений нуклеотидов в различных генах иммуноглобулинов с после­дующей селекцией и экспансией клонов клеток, продуцирующих антитела с повышен­ной аффинностью к первичному антигену [163].

В настоящее время показано, что, наряду с субъединицами, идентичными соответст­вующим компонентам НАДФН-оксидазы фагоцитов, немиелоидные клетки экспресси­руют и их гомологи (табл. 5, рис. 12). Наибольшим количеством изоформ представлена gp91phox (на сегодняшний день их выявлено 7, включая сам белок gp91phox), что не удиви­тельно - ведь именно эта субъединица фактически является ферментом, содержащим все необходимые элементы электронтранспортной цепи и осуществляющим собственно ка­тализируемую НАД(Ф)Н-оксидазой реакцию восстановления молекулярного кислорода до супероксид-аниона, остальные же субъединицы по сути своей - вспомогательные компоненты.

Первым в 1999 г. из клеток карциномы прямой кишки человека и гладкомышечных клеток артерий крысы был выделен гомолог субъединицы gp91phox, названный авторами moxl (mitogenic oxidase 1) из-за предполагаемой роли в регуляции роста и трансформа­ции фибробластов [956], однако впоследствии выяснилось, что стимуляция трансформа­ции была следствием контаминации клеток линии NIH ЗТЗ мутировавшим VI2 Ras [385, 596]. Практически одновременно этот же белок был выделен другой группой исследова­телей, получив название NOH-1 (NADPH oxidase homolog i) [144]. Во избежание пута­ницы в 2000 г. была принята общая номенклатура, по которой гомологи ß-субъединицы флавоцитохрома Ь558 стали называть Nox (NADPH oxidase); вышеописанный гомолог обозначен как Noxl, a gp91phox фагоцитирующих клеток - как Nox2. Белок Noxl челове­ка на 56 % идентичен аналогичной фагоцитарной субъединице, в его состав входят все основные структурные и функциональные домены, характерные для Nox2 (трансмем­бранные сегменты I—VI, участки связывания НАДФН, ФАД и двух гемовых структур) [387, 956]. Изоформа в большом количестве содержится в эпителиоцитах толстого ки­шечника человека и в меньшей степени - в матке, простате и гладкомышечных клетках (у морских свинок - и в желудке [579]), недавно установлено, что она также экспресси­руется эндотелиоцитами некоторых сосудов [100]. Предполагается, что N0x1 играет не­маловажную роль в антимикробной цитотоксической защите организма и в обеспечении врождённого иммунитета: так, показано, что данный гомолог может заменять N0x2 при дефиците последнего, например, в случае хронического гранулёматоза, тем самым час­тично восстанавливая способность клеток организма к генерации супероксид-аниона [385]. Возможно также непрямое участие белка N0x1 в обеспечении противомикробной защиты: при его участии показана активация провоспалительных реакций эпителиоци- тов толстого кишечника по опосредованному фактором №кВ механизму [545]. Обна­ружено, что некоторые агонисты, в том числе тромбоцитарный фактор роста, ангиотен­зин II и простагландин Г2а, повышают уровень мРНК N0x1 в культуре гладкомышечных клеток, а снижение экспрессии N0x1 с помощью антисмысловых методов подавляет ге­нерацию О 2 [956], что указывает на возможное участие N0x1 в индуцированных ангио­тензином II и ростовыми факторами гипертрофии и пролиферации данных клеток.

Таблица 5

Свойства немиелоидных гомологов субъединиц НАДФН-оксидазы человека

Субъединица Молекулярная масса, кДа Длина (число а. к. о.) Хромосомная

локализация

Преимущественная локализа­ция в организме
Noxl 64,9 564 Xq22 Толстый кишечник
Nox3 64,9 568 6q25.1-q26 Ткани эмбриона, орган слуха
Nox4 66,9 578 1 Iql4.2-q21 Почки
Nox5 84,7* 747** 15q22.31 Яички, селезёнка, лимфоузлы
Duoxl 177,2 1551 15ql 5.3 Щитовидная железа, лёгкие
Duox2 175,4 1548 15q 15.3 Щитовидная железа
Noxol 59,7 526 lq25 Толстый кишечник
Noxal 51,7 483 9q34.3 Толстый кишечник

1

Применение. Таблица составлена на основе баз данных «Universal Protein Resource» (http://www.ebi.uniprot.org). «The Human Protein Reference Database» (http://www.hprd.org). «Online Mendelian Inheritance in Man» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): * - по данным UniProt 86,4 кДа; ** - по данным UniProt 765 а. к. о.

В 2000 г. в ткани почек эмбрионов и клетках линии HepG2 обнаружен Nox3 - белок, идентичный Nox2 (gp91phox) на 58 %; в настоящее время обнаруживается главным обра­зом в фетальных тканях (почки, печень, лёгкие, селезёнка) [240], а у крыс и мышей - также и во внутреннем ухе взрослых особей [143]. Генетический дефект Nox3 у мышей приводит к развитию так называемого фенотипа «склонённой головы» (het), у этих жи­вотных обнаруживаются дефекты морфогенезаотокониев (кристаллов внутреннего уха, принимающих участие в восприятии ощущения силы тяжести) и вестибулярные рас-




стройства, проявляющиеся в нарушении равновесия и восприятия ощущения силы тяже­сти [755]; было выдвинуто предположение, что содержащая Nox3 НАД(Ф)Н-оксидаза опосредует АКМ-зависимые изменения конформации отоконина-90, участвующего в образовании центров кристаллизации при формировании кристаллов кальцита в ходе развития отокониев. Повсеместная локализация компонента в органе слуха, в том числе в кортиевом органе и в спиральном ганглии, позволяет предположить и другие его функции [143].

Гомолог Nox4, идентичный фагоцитарной Nox2 на 39 %, первоначально был описан как оксидаза почек (Renox, renal oxidase), поскольку обнаруживался только в почках (у мышей - в проксимальных канальцах коры, у человека - в дистальной части нефрона) [387]; в настоящее время показано, что Nox4 экспрессируется в сердце, поджелудочной железе, плаценте, скелетной мускулатуре, яичниках, яичках, а также в остеокластах, гладкомышечных клетках, эндотелиоцитах, фибробластах, астроцитах [579], гемопоэти­ческих стволовых клетках [780]. Основная роль почечного белка связывается с функ­ционированием в качестве датчика кислорода, регулированием роста клеток и синтезом эритропоэтина [807]; предполагается также, что, подобно gp91phox, он представляет со­бой компонент антимикробной системы, генерируя АКМ в клубочковый фильтрат - именно этим можно объяснить высокий уровень Н202 в моче (около 100 мкМ [1018]). Поскольку работа ферментного комплекса почек, как и всех изоформ НАДФН-оксидазы, сопровождается транспортом протонов, не исключена его роль в регулировании pH и гомеостаза электролитов [387].

Nox5 наименее гомологична другим изоформам (3-субъединицы, её идентичность gp91ph°x фагоцитов составляет 27 % [145]. Помимо консервативных регионов, необходи­мых для функционирования электронтранспортной цепи НАДФН-оксидазы (участки связывания НАДФН, ФАД и гемов), в состав Nox5 входит дополнительный N-концевой фрагмент, содержащий 4 так называемых участка типа «EF-рука»[3], благодаря которым фермент не только способен активироваться ионами кальция, но и может функциониро­вать достаточно автономно, без участия цитозольных компонентов [146]; так, генерация супероксид-аниона клетками, экспрессирующими Nox5, индуцируется иономицином (ионофором кальция, повышающим концентрацию Са2+ в цитоплазме) [145]. мРНК субъединицы Nox5 выявлена в яичках, селезёнке и лимфатических узлах. Локализация компонента в сперматоцитах 1 порядка позволяет предположить его роль как в сперма­тогенезе (деление клеток, апоптоз, упаковка ДНК), так и в функционировании зрелых сперматозоидов (акросомная реакция, проникновение в яйцеклетку); в селезёнке и лим­фоузлах Nox5 экспрессируется в зонах, богатых В- и Т-клетками, и, очевидно, участвует в активации, пролиферации и дифференцировке лимфоцитов [145]. При этом Nox5 не выявляется ни в макрофагах или дендритных клетках селезёнки, ни в лимфоцитах пери­ферической крови [579]. Интересно, что, хотя Nox5 по сравнению с другими гомологами (3-субъединицы наиболее эволюционно далека от фагоцитарной изоформы, с функцио­нальной точки зрения первая и последняя довольно схожи: так, Nox5 активируется вто­ричными мессенджерами (ионы Са2+) и синтезирует О ~2 в относительно больших коли­чествах, в то время как Noxl, Nox3 и Nox4 конститутивно активны и уровень генери­руемого ими супероксид-аниона постоянен и невысок.

В 1999 г. из ткани щитовидной железы был выделен новый НАДФН-оксидазный флавопротеин, названный авторами р138Тох [320]; впоследствии выяснилось, что он представляет собой С-концевой фрагмент одного из уникальных гомологов семейства Nox, по современной номенклатуре, принятой в июне 2001 г. на Гордоновской исследо­вательской конференции по фагоцитам, обозначаемого как Duox2 [598]. «Двойные ок- сидазы» Duoxl и Duox2 (dual oxidase I и 2), называемые также по месту их преимущест­венной локализации «оксидазами щитовидной железы» (ThOXl и ТЮХ2, thyroid oxidase 1 и 2), имеют, помимо схожего с прочими вариантами (3-субъединицы и отвечающего за специфическую супероксид-генерирующую активность С-концевого фрагмента, допол­нительные N-концевые домены - два кальций-связывающих участка «EF-рука», седь­мую трансмембранную а-спираль и, самое необычное и давшее им название «двойст­венных» - обращённый во внеклеточное пространство домен, обладающий пероксидаз- ной активностью (рис. 12) [596, 807]. Duoxl и Duox2 на 83 % гомологичны друг другу и соответственно на 53 и 47 % - субъединице Nox2 фагоцитирующих клеток [1021]. Пе- роксидазоподобные домены белков Duox, в отличие от всех других пероксидаз, не со­держат консервативные остатки гистидина, отвечающие за связывание гемовых групп [387]. Наличие участков EF-hand в молекулах Duox позволяет предположить их прямое регулирование ионами Са2+, что, в частности, подтверждается полученными ранее фак­тами стимуляции синтеза Н202 клетками щитовидной железы под действием ионофоров кальция [319].

В фолликулах щитовидной железы белки Duox обнаруживаются на апикальной по­верхности тиреоцитов, где они, очевидно, служат источником перекиси водорода для тиреопероксидазы - фермента, осуществляющего йодирование и конъюгацию входящих в состав тиреоглобулина остатков тирозина [328, 387]. Достоверно установлено, что Duox2 необходим для синтеза тироксина: так, мутации кодирующего эту изоформу гена приводят к развитию врождённого гипотиреоидизма даже у гетерозигот [705]. Помимо щитовидной железы, у человека Duoxl в больших количествах экспрессируется в лёгких (в эпителии трахеи и бронхов [388]), в меньшей степени - в плаценте, яичках, простате, на уровне предела обнаружения - в поджелудочной железе, сердце [328], аорте, при этом содержание компонента в гладкомышечных клетках интимы и медии аорты суще­ственно повышается в участках атеросклеротического поражения [524]. Duox2, также главным образом представленный в щитовидной железе, в существенных количествах выявляется в толстом кишечнике (в прямой кишке [388]) и в гораздо меньшей степени - в почках, печени, лёгких, поджелудочной железе, простате, яичках [328], слюнных желе­зах [388]. Предполагается, что белки Duox, содержащиеся в эпителиоцитах слюнных желез и в слизистых оболочках прямой кишки и главных воздухоносных путей, играют важную роль в противомикробной защите хозяина. Так, в перечисленных местах контак­та организма с агрессивной внешней средой компоненты, очевидно, работают в тандеме с лактопероксидазой (см. Главу 2), служа для неё источниками перекиси водорода, при этом лактопероксидаза не только в больших количествах содержится в слюне и секретах слизистых оболочек, но и внутриклеточно ко-локализована с белками Duox [388].

Помимо описанных выше гомологов основного компонента НАДФН-оксидазы, её (3-субъединицы, в клетках эпителия толстого кишечника мыши [142] и человека [386, 969] тремя независимыми группами исследователей недавно обнаружены изоформы ци­тозольных субъединиц p47phox и p67phox - соответственно Noxol (NAD(P)H oxidase organizer I; первоначальное название p41nox) и Noxal (NAD(P)H oxidase activator ]_; пер­воначальное название p51nox) [387, 807]; субъединицы ко-локализованы с белком Noxl и, очевидно, обеспечивают регуляцию и поддержку его супероксид-генерирующей актив­ности. Хотя гомологичность аминокислотных последовательностей Noxol и p47phox не­велика (27 % идентичности), тем не менее Noxol содержит все необходимые домены.


обеспечивающие специфические функции фагоцитарного аналога [387, 596] (рис. 13): И-концевой домен РХ, участвующий во взаимодействии с фосфолипидами мембраны; тандем из двух БНЗ-доменов, обеспечивающий связывание с флавоцитохромом; С-концевой полипролиновый мотив, с помощью которого белок связывается с доменами БНЗ. Исключением является характерный для р47рЬох поликатионный самоингибирую- щий участок, по которому осуществляется фосфорилирование субъединицы при актива­ции и самосборке фагоцитарного ферментного комплекса - этот фрагмент не входит в состав Ктохо1; таким образом, N0x01 конститутивно активна и её БНЗ-домены всегда доступны для связывания с каталитическим компонентом N0x1, что согласуется с кон­ститутивной природой НАД(Ф)Н-оксидаз на основе N0x1 [956].

N0X81 также обнаруживается главным образом в эпителиоцитах толстого кишечника, однако, в отличие от N0x01, имеет более широкое распространение в организме [969]. По аминокислотной последовательности белок на 28 % идентичен цитозольному компо­ненту р67рЬох и содержит практически все аналогичные функционально значимые участ­ки: четыре ^концевых мотива ТРЯ, с которыми связывается субъединица Яас1; «домен активации», отвечающий за взаимодействие с флавоцитохромом; домен РВ1 и один С- концевой фрагмент БНЗ, способный связываться с компонентами N0x01 и р47рЬох [142, 386, 969]. Совместно с каталитической субъединицей N0x1, белками р22рЬох и Яас ком­поненты N0x01 и N0x31, очевидно, представляют собой характерный для толстого ки­шечника супероксид-генерирующий комплекс, аналогичный фагоцитарной НАДФН-
оксидазе как по составу, так по защитной антимикробной функции [387], при этом хотя и существует некоторая взаимозаменяемость субъединиц (p47phox и p67phox способны усиливать спонтанную и ФМА-стимулированную генерацию О ~2 субъединицей Noxl в клеточных системах in vitro), наиболее активно ферментный комплекс на основе Noxl синтезирует супероксид-анион при участии Noxol и Noxal [142, 545, 969]. При этом вполне вероятно, что цитоплазматические белки Noxol и Noxal участвуют в регуляции и активации супероксид-генерирующей активности и других белков-членов семейства Nox/Duox, поскольку экспрессируются не только в толстом кишечнике, но и в других тканях, органах и клетках - в щитовидной железе, слюнных железах, почках, поджелу­дочной железе, эндотелиоцитах, гладкомышечных клетках [386, 969].

В настоящее время вопрос структурной организации НАД(Ф)Н-оксидазных комплек­сов различной локализации интенсивно изучается, однако уже сегодня можно сказать, что НАД(Ф)Н-оксидаза - нечто вроде детского конструктора, где сходные детали (функционально гомологичные субъединицы) в принципе взаимозаменяемы, и вариа­бельность их компоновки позволяют Природе использовать получившиеся разнообраз­ные конструкции в разных целях. Так, даже в клетках одного типа в зависимости от их локализации в организме выявляется разный спектр этих «конструкций»: например, если эндотел иоциты аорты содержат Noxl лишь в следовых количествах, то в эндотел иоци­тах церебральных артерий данного белка на порядок больше, при этом клетки содержат также изоформы Nox2 и Nox4. Более того, изоформы по-разному распределены: Noxl располагается преимущественно в кавеолах, Nox2 - в перинуклеариой области, Nox4 - в местах адгезии [100]. Недавно на культуре клеток яичника китайского хомяка СНО по­казано, что «организаторы» p47phox и Noxol усиливают генерацию супероксид-аниона компонентом Nox3, при этом р47рЬох-зависимое увеличение ещё больше возрастает в присутствии «активаторов» p67phox и Noxal, в то время как Noxol-зависимое - снижает­ся, то есть «активаторы» могут регулировать активность Nox3 позитивно или негативно в зависимости от вида входящего в НАД(Ф)Н-оксидазный комплекс «организатора» [1000].

Если для субъединиц gp91phox, p47phox и p67phox выявлены гомологи, то субъединица p22phox, по-видимому, является неизменным критическим элементом, определяющим продукцию О 2 [1004]. Образование О ~2 эндотелиоцитами и гладкомышечными клетка­ми сосудов приводит к инактивации NO-радикалов и нарушению тонуса сосудов, что может являться причиной развития сердечно-сосудистых патологий; при этом так как в нефагоцитирующих клетках сосудов субъединица p22phox - критический элемент актива­ции НАД(Ф)Н-оксидазы и продукции О ~2 , то предпринимаются попытки связать поли­морфизм гена p22phox с определёнными заболеваниями.

Наличие НАДФН-оксидазных систем в разных типах клеток поднимает интересный вопрос их эволюционного происхождения: данные мембрансвязанные системы переноса электронов на молекулярный кислород появились либо как защитный механизм, кото­рый трансформировался в регуляторный, либо как регуляторный, который в последую­щем стал использоваться для неспецифической защиты. Интересным примером пере­ключения функции супероксидгенерирующего ферментного комплекса с сигнальной на цитотоксическую (протективную) может служить работа итальянских учёных [780], вы­явивших в гемопоэтических клетках человека фагоцитарную субъединицу Nox2, функ­ция которой не связана с защитой хозяина, поскольку она обладала конститутивной ак­тивностью (способностью к постоянной генерации небольших количеств О2) и не сти­мулировалась стандартными индукторами дыхательного взрыва (ФМА, арахидонат, бак­териальный липополисахарид). Авторы предполагают, что в недифференцированных гемопоэтических клетках-предшественниках Nox2 служит в качестве датчика кислорода и выполняет регуляторную роль, участвуя в реализации программы пролифера- ции/дифференцировки и контролируя митохондриогенез, когда же клетка получает ком- митирующий сигнал к дифференцировке, в ходе созревания она либо теряет субъедини­цу (будущие эритроциты), либо приобретает дополнительные вспомогательные компо­ненты, благодаря которым Nox2 превращается в зрелых фагоцитах в полноценный НАДФН-оксидазный комплекс, осуществляющий антимикробную и цитотоксическую функции.

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме НАДФН-оксидаза:

  1. Дыхательный взрыв
  2. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  3. Метаболизм гранулоцитов и макрофагов в состоянии относительного покоя и при фагоцитозе
  4. ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЕТОНОВ
  5. ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ДЕГАЛОГЕНИРОВАНИЕ
  6. Метаболизм гранулоцитов и макрофагов в состоянии относительного покоя и при фагоцитозе
  7. Алкаптонурия
  8. Ферментативная активность.
  9. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АЗОСОЕДИНЕНИЙ
  10. ФЛАВИНЗАВИСИМАЯ МОНООКСИГЕНАЗА
  11. ГЕМОКСИГЕНАЗА
  12. Патогенез
  13. ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ
  14. ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ
  15. Список принятых сокращений
  16. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ЭПОКСИДОВ