Общие сведения о методах и испытаниях ЛС на токсичность, стерильность и микробиологическую чистоту

Доклинические испытания лекарственных средств. Будущее лекарство проходит многостадийный путь испытаний по различным параметрам. Первый этап — доклинические испытания.

Доклинические исследования биологически активных веществ принято условно подразделять на фармакологические и токсикологические.

Целью фармакологических исследований является оценка специфической фармакологической активности ЛС.

Фармакологические исследования проводятся на моделях соответствующих заболеваний или патологических состояний с применением однократно вводимых, постоянно возрастающих доз веществ в целях поиска необходимого эффекта. Например, при исследовании новых антиаритмических препаратов класса амидов у животных вызывают искусственную аритмию. ЛВ считается обладающим специфической (антиаритмической) активностью, если способствует снятию данной патологии.

При токсикологических исследованиях Л С устанавливают характер и выраженность возможного повреждающего воздействия на организм экспериментальных животных.

Исследование ЛС на токсичность проводят в лабораторных условиях, устанавливают острую и хроническую токсичность. Исследования строго регламентируются соответствующими нормативными документами, в которых определяется схема и порядок проведения опытов, условия содержания и рацион кормления животных, их число, способы введения препаратов, время, объем вводимого препарата, продолжительность наблюдения, описание состояния животных и т.д.

Определение острой токсичности. При изучении острой токсичности устанавливают зависимость доли погибших животных, % от дозы испытываемого вещества (рис. 2.5). По экспериментальной кривой «доза—ответ» определяют показатели: ЛД10 (доза, при которой гибнет 10 % подопытных животных) и ЛД5о (доза, при которой гибнет 50 % подопытных животных).

для расчета эффективной дозы для человека вводят соответствующие поправочные коэффициенты.

Токсикологические характеристики позволяют оценить границы безопасности ЛС (широту терапевтического действия), которая находится в диапазоне от минимальной эффективной до минимальной токсической дозы. При доклинических испытаниях в опытах на животных определяют терапевтический индекс Thl= TD50/ED50, т. е. отношение средней токсичной дозы к средней эффективной для заданного эффекта.

Определение хронической токсичности. Определение хронической токсичности вещества проводят при его ежедневном вве-

дении в течение определенного времени в трех дозах: 1) близкой к терапевтической; 2) предполагаемой терапевтической; 3) максимальной терапевтической. В течение эксперимента снимают следующие показатели: объем потребления животными корма и воды; динамику изменения массы тела, изменение общего состояния и поведения; гематологические и биохимические показатели и др.

После завершения эксперимента по определению острой и хронической токсичности проводят патоморфологические и гистологические исследования внутренних органов, мозга, костей, глаз подопытных животных.

На заключительном этапе исследований устанавливают специфическую токсичность испытываемого вещества: его канцерогенное, мутагенное, аллерги- зирующее, иммунотоксическое действие; эмбриотоксичность; гонадотоксич- ность и т.д.

После окончания проверки всех видов токсичности составляется протокол, который включает параметры эксперимента и заключение о токсичности испытываемого вещества.

Клинические испытания лекарственных средств.

Для проведения клинических испытаний заводом-изготовителем вырабатывается определенное количество препарата, контролируется его качество в соответствии с требованиями, заложенными в ФСП, затем он фасуется, маркируется (указывается «Для клинических испытаний») и направляется в медицинские учреждения.

Первый этап клинических испытаний ЛС осуществляется на 30 — 50 добровольцах. Следующий этап — расширенные испытания на базе 2 — 5 клиник с привлечением большого числа (нескольких тысяч) больных. При этом заполняются индивидуальные карты больных с подробным описанием результатов различных исследований — анализов крови, мочи, УЗИ и др.

На этом этапе в Фармакологический комитет продолжают поступать новые данные по пострегистрационным испытаниям.

Клинические испытания новых лекарственных средств (препаратов) проводятся с соблюдением требований международного стандарта GCP.

Клинические испытания являются наиболее ответственным и важным этапом изучения нового лекарственного препарата. Именно на основании результатов клинических испытаний должна быть определена его судьба, т. е. подтверждена или отвергнута целесообразность применения в медицинской практике.

Программа клинических испытаний должна проходить обязательную экспертизу в комиссии по вопросам этики. Существуют международные акты об этических аспектах проведения медицинских исследований на людях, например, Нюрнбергский кодекс (1947) и Хельсинкская декларация (1964). В этих документах отражены вопросы неприкосновенности здоровья человека, рекомендации для врачей по биомедицинским исследованиям на людях.

Участвующие в испытании нового препарата пациенты (добровольцы) должны получить информацию о сути и возможных последствиях испытаний, ожидаемой эффективности лекарства, степени риска, заключить договор о стра- хований жизни и здоровья в порядке, предусмотренном законодательством, а во время испытаний находиться под постоянным наблюдением квалифицированного персонала.

При проведении клинических испытаний с участием большого количества пациентов современный уровень развития компьютерной техники позволяет осуществить обработку результатов исследований через специальные программы в системе Internet, привлекая к сбору информации и обсуждению результатов клиницистов различных стран.

Микробиологический контроль в процессе производства лекарственных средств.

Для лекарственных препаратов регламентируется надлежащая микробиологическая чистота. Загрязнение микроорганизмами может происходить на разных стадиях производства. Поэтому испытания на микробиологическую чистоту осуществляются на всех стадиях получения ЛС. Основными источниками микробной контаминации являются сырье, вода, оборудование, воздух производственных помещений, упаковка готовой продукции, персонал. Для количественного определения содержания микроорганизмов в воздухе используются различные методы отбора проб: фильтрация, осаждение в жидкостях, осаждение на твердые среды. Для оценки микробиологической чистоты проводят испытания на стерильность.

При определении стерильности ЛС, обладающих выраженным антибактериальным действием, бактериостатическими, фунгистатическими свойствами, а также лекарственных средств, содержащих консерванты или разлитых в емкости более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации.

При контроле стерильности лекарственных форм р-лактамных антибиотиков возможно использование в качестве альтернативного метода прямого посева с применением фермента пенициллиназы в количестве, достаточном для полной инактивации испытуемого антибиотика.

Применение метода мембранной фильтрации основано на пропускании ЛС через полимерную мембрану.

Для подсчета жизнеспособных микроорганизмов обычно используют мембраны из эфиров целлюлозы (нитроцеллюлозы, ацетоцеллюлозы и смешанных эфиров целлюлозы) с размером пор 0,45 мкм.

Техника проведения испытаний на микробиологическую чистоту лекарственных средств с использованием метода мембранной фильтрации приведена в дополнении к ФС «Испытание на микробиологическую чистоту» от 28 декабря 1995 г.

Испытания на пирогенность инъекционных препаратов. Необходимость проведения этого теста связана с присутствием в инъекционных препаратах фрагментов клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, вирусов и эндотоксинов. Применение таких препаратов вызывает, жар, озноб, тошноту, иногда летальный исход. Причем наибольшую опасность представляют эндотоксины, которые являются термостабильными и состоят из липополисахаридов внешней плазматической мембраны грамотрицательных бактерий, попадание которых в организм человека провоцирует резкий воспалительный процесс.

Вот почему содержание пирогенных примесей в инъекционных растворах, согласно требованиям ГФ и GMP, должно быть сведено к минимуму. Контроль содержания пирогенных примесей в инъекционных препаратах проводят двумя методами: в опытах in vivo на кроликах и in vitro с использованием ЛАЛ- реактивов, приготовленных из крови мечехвостов (ЛАЛ-тест).

Испытания на кроликах приведены в ГФ. Испытания проводят на 12 кроликах породы шиншилла, массой 2,5 —3,0 кг с соблюдением строгого стандартного рациона питания в специально оборудованном тихом, светлом, без перепадов температуры помещении. Кроликов помещают в специально оборудованные индивидуальные боксы, позволяющие проводить постоянное измерение температуры, которая записывается в автоматическом режиме самописцем, что исключает фальсификацию данных.

В начале опыта препарат вводится трем животным.

Данный метод имеет ряд недостатков. В эксперименте используют животных, чувствительность которых к пирогенам в 3 — 4 раза ниже, чем у человека. Это требует соответствующего увеличения тест-дозы. Кроме того, многие лекарственные вещества в дозах, близких к терапевтическим, могут вызвать токсические реакции и даже гибель животных. Поэтому используется заниженная величина тест-доз (инфузионные растворы глюкозы, антибиотики — бензил- пенициллина натриевая соль, линкомицина гидрохлорид и др.). На проведение одной серии опыта требуется около 5 ч.

Л А Л-т ест (Limulus Amebocyte Lysate). Впервые ЛАЛ-тест был включен в Фармакопею США в 1980 г., а позже был признан в европейских странах. В Фармакопее США многие ФС регламентируют проведение испытаний препаратов с помощью ЛАЛ-теста. В некоторых случаях испытания на пирогенность рекомендуется проводить с использованием теста на кроликах. В 1997 г. в России Государственный фармакопейный комитет впервые утвердил временную общую Фармакопейную статью 42-2960—97 «Определение содержания бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест)».

Суть теста заключается в контроле процесса взаимодействия эндотоксинов с лизатом клеток (амебоцитов) крови мечехвостов — морских членистоногих, в результате которого происходит образование геля («гель-тромб тест»), визуально наблюдаемого или фиксируемого турбодиметрическим или хромогенным методами.

ЛАЛ-реактив готовят из лизированной крови мечехвостов, которых вылавливают на мелководье у берегов Бостона в США и используют в качестве доноров крови. ЛАЛ-реактив представляет собой сублимированный порошок, стабильный в течение 4 лет. Порошок растворяют в определенном количестве воды: 0,5; 0,25; 0,125; 0,030; 0,015 мл. Стандартный образец, приготовленный из лиофильно высушенных клеток Е. соН с полиэтиленгликолем (Контрольный стандарт эндотоксина — CSE), содержит 500 нг эндотоксина. Для определения используется 0,1 мл ЛАЛ-реакгива и 0,1 мл испытываемого вещества, которые помещают в луночные планшеты.

Гель-тромб тест считается положительным, если при переворачивании планшета образованный гель не сползает из лунки планшета. Отрицательным считается результат, когда образование геля не происходит. Это указывает на присутствие в препарате эндотоксинов, ингибирующих процесс гелеобразования.

Основными преимуществами ЛАЛ-теста по сравнению с традиционным испытанием на кроликах являются: возможность оценки уровня бактериальных эндотоксинов в тех препаратах, которые невозможно проверить на животных; более высокая чувствительность ЛАЛ-теста (в 100 раз); быстрота выполнения (одно испытание занимает около 1,5 ч); испытания проводит один человек.

Более высокая чувствительность и быстрота ЛАЛ-теста обеспечивают возможность контроля качества воды для приготовления инъекционных лекарственных средств в условиях производства. Этот тест используется для анализа «Воды инъекционной в ампулах», «Раствора натрия хлорида 0,9 % для инъекций», различных лекарственных форм инсулина. В настоящее время список препаратов, представленных в Фармакопейный комитет на ЛАЛ-тест, включает аминазин, анальгин, глюкозу, диклофенак, растворы морфина, новокаина и некоторые другие ЛС.

2.7.