<<
>>

Перекись водорода

Перенос двух электронов на молекулу кислорода или одного электрона на супероксидный анион-радикал О 2 сопровождается образованием двухзарядного аниона О 2 . В свободном состоянии такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной [52].

Присоединяя протоны, он переходит в гидроперекисный анион НО 2 или Н202, при этом при физиологических значениях pH вследствие высокого рКа преобладает Н202 [218]. Перекись водорода относят к окисли­телям средней силы, при этом, не будучи радикалом, она взаимодействует с веществами как радикальным, так и нерадикальным путём. В водных растворах в отсутствие катала­зы, пероксидаз и ионов металлов переменной валентности Н202 относительно стабильна и, будучи электростатически нейтральной молекулой (не имеет заряда), легко проникает сквозь гидрофобные мембраны и может мигрировать в клетки и ткани [48, 958]. Наличие нейтральных аддуктов Н202 (например, гистидина) обеспечивает её проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы [892].

В аэробных организмах главными эндогенными источниками Н202 служат фермента­тивные реакции с оксидазами, переносящими два электрона на молекулу кислорода: ксантиноксидаза, оксидазы Ь-аминокислот, моноаминоксидаза и ряд других, а также реакция дисмутации, катализируемая СОД, рис. 5. Около 80 % Н202, генерируемой фа­гоцитами в очаге воспаления (рис. 11), образуется в реакции дисмутации О 2 суперок- сиддисмутазой [992].

В клетках эукариот ферменты, нарабатывающие перекись водорода, локализованы преимущественно в пероксисомах. Пероксисомы представляют собой окружённые одно­слойной мембраной внутриклеточные структуры диаметром от 0,1 до 1,7 мкм, содержа­щие гранулярный матрикс, в центре которого часто видны кристаллоподобные структу­ры, состоящие из фибрилл и трубок (сердцевина); обнаруживаются они почти во всех эукариотических клетках. Впервые органеллы были выделены Кристианом Рене Де Дю- вом, впоследствии лауреатом Нобелевской премии, с сотр. [296]. Исследователи показа­ли, что тельца содержат как синтезирующие перекись водорода оксидазы, так и разру­шающую её каталазу, и предложили соответствующее название - «пероксисомы», вза­мен введённого в 1954 г. морфологом Родином термина «микротельца» [835],

В настоящее время обнаружено, что пероксисомы млекопитающих содержат более 50 ферментов, участвующих во множестве метаболических путей, в том числе: (3-окислении длинноцепочечных жирных кислот, простагландинов и лейкотриенов (неподходящих для митохондриального Р-окисления субстратов); биосинтезе холестерина, желчных кислот, долихола и эстерифицированных липидов (плазмалогенов); окислении Б-аминокислот, полиаминов и мочевой кислоты (у не относящихся к приматам животных); детоксикации ксенобиотиков, глиоксалата; и, наконец, синтезе и катаболизме перекиси водорода и других АКМ (табл. 7) [297, 890].

Таблица 7

Ферменты пероксисом млекопитающих, участвующие в синтезе и деградации перекиси водорода

и других АКМ [890]

Фермент КФ Субстрат Форма

АКМ

Ацил-КоА-оксидазы: 1.3.3.6
Пальмитоил-КоА-оксидаза Длинноцепочечные жирные кисло­ты Н202
Пристаноил-КоА-оксидаза 2-Метил-разветвлённые жирные кислоты Н202
Тригидроксикопростаноил-КоА-
оксид аза Интермедиаты желчных кислот н202
Оксидаза Б-аминокислот 1.4.3.3 Б-пролин н202
Б-аспартатоксидаза 1.4.3.1 Б-аспартат, Ы-метил-Б-аспартат н202
Оксидаза а-гидроксикислот (гли- колатоксидаза) 1.1.3.15 Гликолат, лактат Н202
Оксидаза пипеколовой кислоты 1.5.3.7 Ь-гшпеколовая кислота Н202
Оксидаза полиаминов 1.5.3.11 А-ацетилспермин,

У-ацетилспермидин

н202
Уратоксидаза (уриказа) 1.7.3.3 Мочевая кислота Н202
І Ксантиноксидаза 1.2.3.22 Ксантин О", Н202
ЫО-синтаза 1.14.13.39 Ь-аргинин N0*
Каталаза 1.11.1.6 Н202
Г лутатионпероксидаза 1.11.1.9 Н202
Си,2п-С0Д 1.15.1.1 о;
Мп-СОД 1.15.1.1 о-
Эиоксидгидроксилаза 3.3.2.3 Эпоксиды
Пероксиредоксин 1 Н202


Удивительным свойством пероксисом является то, что эти клеточные компоненты индуцибельны.

Пролиферация пероксисом печени индуцируется некоторыми ксенобио­тиками, такими как гиполипидемические лекарственные препараты или пластификаторы на основе эфиров фталата [825], а также перфторатами, нафенопином, клофибратом, ацетилсалициловой кислотой [223]. Индукция сопровождается интенсификацией про­цессов ПОЛ с одновременной индукцией ряда антиоксидантных ферментов [223].

Исследования на клеточных культурах показывают, что при добавлении в культу­ральную среду Н202 в низких концентрациях (< 10 мкМ) наблюдается усиление клеточ­ной пролиферации, более высокие концентрации останавливают рост и вызывают гибель клеток посредством апоптоза или некроза. Несмотря на хорошую проницаемость мем­бран для Н202, ее внутриклеточная концентрация в 8-10 раз ниже внеклеточной, что связано с наличием каталазы и пероксидаз, разлагающих перекись водорода. Биологиче­ский эффект Н202 на некоторую усредненную культуру клеток млекопитающих можно представить следующим образом:

Экзогенная Н202 (мкМ)


Внутриклеточная Н202 (мкМ)

В патофизиологически достижимых миллимолярных концентрациях (в качестве примера можно привести такие данные: при стимуляции суспензии нейтрофилов 3 х 105 мл концентрация Н202в среде достигает 15 мкМ, а в воспалённых криптах толстой киш­ки содержится более 2,6 х 107 нейтрофилов/мл [733, 983]) перекись водорода обладает цитотоксическим действием и вызывает гибель в культуре фибробластов [918], гепато- цитов [858] и гладкомышечных клеток [98, 911]. Кроме того, показано, что Н202 инду­цирует апоптотическую гибель опухолевых клеток [619], эндотелиоцитов [293], 1ЫК- клеток [452] и 3-лимфоцитов ВИЧ-инфицированных людей [872]. Разные субпопуляции лимфоцитов не одинаково чувствительны к цитотоксическому действию перекиси водо­рода. Наиболее устойчивыми являются Т-хелперы [341, 1109], что может быть причиной изменения соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры и общей супрессии пролиферации лимфоцитов, вызываемой активированными нейтрофилами. У ВИЧ-инфицированных людей, наоборот, уязвимость Т-хелперов резко повышается (рост клеток в культуре за­медляется при концентрации Н202 больше 10 мкМ), в основе этого лежит снижение внутриклеточного содержания каталазы и восстановленного глутатиона [872, 873]. Вы­сокая чувствительность Т-хелперов к окислительному стрессу является причиной уменьшения численности данной популяции клеток при развитии клинических проявле­ний СПИДа.

Генерация АКМ, и в том числе Н202, при взаимодействии активированных хемотак- синами нейтрофилов крови с эндотелиоцитами служит одной из основных причин по­вреждения эндотелия и подлежащих тканей при остром воспалении и постишемическом
поражении. Показано, что 15 000 нейтрофилов, прилипших к монослою эндотелиоцитов под действием фактора активации тромбоцитов (100 нг/мл), за 2 часа инкубации выде­ляют субнаномолярное количество Н202 [902]. В то же время в экспериментах in vivo показано, что прилипание 50 нейтрофилов на 100 мкм сегмента венулы, вызванное фак­тором активации тромбоцитов, приводит к окислительному взрыву на этом участке ве­нулы такой же силы, как и при перфузии сосуда субмиллимолярными концентрациями органической гидроперекиси [954]. Столь мощное прооксидантное действие сравни­тельно небольшого количества клеток объясняется экранированием выделяемой Н202 от антиоксидантов плазмы (перекись водорода генерируется только той стороной мембра­ны гранулоцита, которая соприкасается с поверхностью эндотелиоцита) и возникнове­нием ОН* в результате взаимодействия с ферритиновым железом эндотелиальных кле­ток, а также индукцией ПОЛ в мембранах [954].

Механизмы цитотоксического действия Н202 довольно разнообразны. Так, in vitro в концентрациях 0,1-2,5 мМ Н202 вызывает однонитевые разрывы ДНК, что может слу­жить причиной гибели эпителиальных клеток респираторных путей - одного из главных участков выхода и разрушения гранулоцитов крови [675], а также Т-лимфоцитов ВИЧ- инфицированных людей [872], при этом фрагментация молекул ДНК является важным признаком апоптотической гибели этих клеток. Под действием Н202 в клетках наблюда­ется снижение интенсивности гликолиза в результате инактивации альдегиддегидроге- назы и уменьшения содержания лактата; индукция процессов ПОЛ приводит к измене­нию физических свойств цитоплазматических мембран [177], в результате чего ингиби­руется трансмембранный перенос анионов [298, 481], но увеличивается проницаемость для макромолекул [1064]; возрастает внутриклеточная концентрация Са2+, что приводит к активации фосфолипаз и обмена фосфатидилинозитолов [54]; наблюдается истощение пула АТФ, что сопровождается гибелью клеток [18].

Цитотоксическое действие Н202 in vivo может реализовываться через инактивацию ингибитора протеиназ [1043, 1076] и активацию сывороточных белков системы компле­мента по альтернативному пути [910], что, в частности, приводит к увеличению содер­жания фракции С5а, обладающей высокой хемотаксической активностью [909]. При действии перекиси водорода наблюдается инактивация ферментативных антиоксидантов каталазы и ГПО [781]. Н202 является источником возникновения высокореакционного гидроксильного радикала [6, 152], а в присутствии миелопероксидазы, пероксидазы эо- зинофилов и лактопероксидазы - гипогалогенных кислот (НОС1, НОВг, HOI, HOSCN), которые также цитотоксичны и важны для микробицидного действия гранулоцитов [640, 678, 1045]. Наработка перекиси водорода приводит к закислению среды в фагосоме и очаге воспаления [638], что индуцирует диссоциацию железа из ферритина [152, 1070]. Н202 также вызывает деградацию гемовых белков, что, в частности, приводит к высво­бождению ионов железа из гемоглобина [89, 436] и миоглобина [805, 806]; это. в свою очередь, усиливает цитотоксическое действие самой перекиси, которое возрастает в 10-И000 раз в присутствии каталитически активных ионов железа [324, 633]. Хотя мно­гие исследователи связывают образование Н202 с деструктивным действием в очаге вос­паления, перекись водорода может также снижать цитотоксический эффект фактора некроза опухоли и таким образом защищать клетки от повреждения [154].

Устойчивость клеток млекопитающих к действию Н202 определяется наличием глу- татионпероксидазной и каталазной ферментативных систем [992], первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая - при высоких [324] (см. Главу 2). Уровень внутриклеточных глутатион пероксидазы и каталазы зависит и, возможно, регулируется образованием Н202. Регуляторная роль Н202, но не О \ и ОН*, показана также для синтеза меланина в коже [536]. Действие ультрафиолетового света на меланоциты приводит к образованию в них Н202, которая в свою очередь усиливает в клетках активность тирозиназы, отвечающей за начальную стадию превращения тирози­на в меланин. Повышенный уровень образования меланина необходим для защиты кле­ток кожи от фотоиндуцированного повреждения.

Эндотелиоциты, одни из наиболее часто контактирующих с гранулоцитами клеток, обладают наружной системой защиты от Н202 иО^, генерируя высоко- и низкомолеку­лярные «дефенсины» [275]. К их числу относят:

аденозин, выделяемый покоящимися и Н202-стимулированными эндотелиоцитами и ингибирующий синтез нейтрофилами перекиси водорода и супероксид-аниона;

простациклин, который нарабатывается эндотелиальными клетками в ответ на фло- гогены (брадикинин, гистамин, ангиотензин И, тромбин, С5а, Н202 нейтрофильного происхождения) и подавляет дыхательный «взрыв» гранулоцитов посредством по­вышения в них концентрации цАМФ;

возможно, N0* - наработка его эндотелиоцитами связана с синтезом простациклина, также показано прямое угнетение генерации ОI путём непосредственного воздейст­вия N0* на НАДФН-оксидазу нейтрофилов [251, 910].

Наличие многоуровневой системы защиты от Н202 делает клетки достаточно рези­стентными к её цитотоксическому действию. Считается, что большинство клеток устой­чивы к концентрациям перекиси водорода меньше 50 мМ, однако в концентрациях от 0,1 до 50 мМ Н202 способна вызывать различные функциональные изменения в клетках, что позволяет рассматривать ее как важный внутриклеточный мессенджер [18].

В сублетальных концентрациях (1-50 мМ) перекись водорода существенно модифи­цирует статус эндотелиальных клеток: интенсифицируется синтез фактора активации тромбоцитов [626], активатора тканевого плазминогена [905], усиливается секреция простагландинов Е2 и 12 [18]; снижается связывание фактора некроза опухоли в резуль­тате уменьшения числа рецепторов к нему на поверхности эндотелиоцитов [193]. Н202 повышает адгезию тромбоцитов [904] и нейтрофилов [626, 771] к эндотелию, что, по- видимому, обусловлено стимулированием продукции в эндотелиоцитах фактора актива­ции тромбоцитов [404] и повышением экспрессии на их поверхности рецепторных мо­лекул, в частности ICAM-1, Р-селектина и главного комплекса гистосовместимости класса I [193, 635, 771]. При этом пролонгированность повышения экспрессии Р-селектина объясняют тем, что механизмы реинтернализации молекул адгезии либо не индуцируются, либо ингибируются перекисью водорода [404]. Возникающее параллель­но с индуцированным Н202 повышением адгезии тромбоцитов и гранулоцитов повреж­дение Cu,Zn-COfl ослабляет антиоксидантную защиту клеток и тем самым делает их более уязвимыми к действию АКМ в условиях окислительного стресса [865]. Кроме то­го, в миллимолярных концентрациях Н202 дозозависимо усиливала окислительный взрыв в нейтрофилах человека [1067] и мышиных макрофагах [18] в ответ на хемотакси- ческий пептид.

На уровне целого организма отравление Н202 (абсолютно смертельная доза для крыс - 500 мг/кг) приводит к обширной газовой эмболии и повышению активности ядер блу­ждающего нерва [42], в результате чего нарушается функция дыхания и наступает смерть. Известны живые организмы, способные синтезировать и хранить высокие кон­центрации Н202. Так, жук-бомбардир (подсемейство семейства жужелиц), обороняясь, выбрасывает едкую жидкость, температура которой достигает 100 °С. Для получения такой жидкости в специальном резервуаре запасается реакционная смесь, содержащая 25 % Н202 и 10 % гидрохинона и метилгидрохинона; затем смесь подаётся в камеру с каталазой и пероксидазой, в результате экзотермической реакции смесь разогревается и на воздухе выброшенная струя жидкости превращается в облачко пара (отсюда и назва­ние «бомбардир»).

Необходимо отметить, что перекись водорода нельзя рассматривать как исключи­тельно токсическую и деструктивную молекулу; в живых системах она проявляет свой­ства физиологического регулятора. Установлено, что, наряду с оксидом азота, Н202 слу­жит важным стимулятором индуцированной кровотоком вазодилатации: на коронарных артериях человека показано, что под действием сдвигового напряжения повышается синтез эндотелиоцитами Н202 (предположительно, мембрансвязанными ферментами), что приводит к открытию кальций-зависимых калиевых каналов гладкомышечных кле­ток сосудов, их гиперполяризации и релаксации [695]. Такой механизм может играть важную роль в поддержании кровоснабжения миокарда при постишемической реперфу­зии, когда уровень N0* снижен. В концентрации 10'6 М перекись водорода усиливала пролиферацию фибробластов в культуре, а в концентрации 10'3 М - ингибировала [715]. В клетках Jurkat Н202 повышала репликацию вируса ВИЧ-1 посредством активации ядерного фактора транскрипции NF-kB [528]. Как показано на цельной слизистой обо­лочке толстой кишки [535] и монослое клеток аденокарциномы линии Т84 [733], Н202 в концентрации около 2 мМ может модулировать секреторную активность кишечника.

Регистрация перекиси водорода может осуществляться спектрофотометрически по поглощению при 240 нм (е = 46,3 М'1), амперометрически с помощью специально разра­ботанных биосенсоров для Н202 [173], полярографически по образованию 02 при разло­жении каталазой, спектрофото- и спектрофлуорометрически по образованию окрашен­ных продуктов в реакциях окисления доноров протонов в присутствии пероксидазы хре­на. Для регистрации Н202 в биологических средах разработан фотохимический метод с пределом обнаружения 0,03 мкг/см3 [776].

Для измерения Н202 в отдельных клетках с помощью проточной цитофотометрии предложен чувствительный метод, основанный на регистрации флуоресценции 2’,7'- дихлорофлуоресцеина (возбуждение при 498 нм, излучение при 522 нм), образующегося при окислении перекисью водорода 2',7'-дихлорофлуоресцина (рис. 25) [541, 1100]. Од­нако данный метод не специфичен для Н202 (2',7'-дихлорофлуоресцин окисляется также супероксид-анионом, оксидом азота, пероксинитритом, гипохлоритом [434, 606, 973]), поэтому более корректным считается говорить об измерении с его помощью не образо­вания Н202, а, например, активности дыхательного «взрыва» в фагоцитах [1036], про­дукции АКМ [183, 606] или даже активности окислительного стресса [132]. Кроме того, необходимо учитывать возможность прямого окисления 2',7'-дихлорофлуоресцина неко­торыми редокс-активными соединениями (пиоцианин, феназинметосульфат, митоксан- трон, аметантрон) [746]. —

С помощью спектрофлуориметрических методов перекись водорода измеряется так­же в тройной системе «Н202 - пероксидаза (обычно пероксидаза хрена) - донор прото­нов (флуорогенный субстрат)», в которой в присутствии перекиси водорода происходит окисление ферментом молекулы-детектора. При использовании в качестве субстрата яяря-гидроксифенилуксусной, яяря-гидроксифенилпропионовой, гомованилиновой (4-гидрокси-З-метоксифенилуксусной) кислот, тирамина, К-ацетил-3,7-дигидро- ксифеноксазина в ходе реакции возникают флуоресцирующие соединения [772, 973] (рис. 26); в результате окисления светящегося скополетина (7-гйДрЪкСТьб- метоксикумарина), напротив, образуется нефлуоресцентный продукт. На таком же принципе основаны спектрофотометрические методы, где в тройной системе окисляют-

НЕФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ

СОЕДИНЕНИЯ СОЕДИНЕНИЕ

1ПСО


Г омованилиновая кислота

Рис. 26. Принцип регистрации Н202 с помощью тройной системы «Н202 - пероксидаза - флуоро-

генный субстрат»

Для определения перекиси водорода разработаны высокочувствительные хемилюми­несцентные методы, основанные на регистрации свечения, возникающего в реакции с бис(2,4,6-трихлорфенил)оксалатом, для которого наблюдается линейная зависимость свечения от концентрации Н202 в диапазоне концентраций 10 8^10 3 М [1090]. Наиболее широко для регистрации Н202 применяется хемилюминесцентная система «люминол - Н202 - катализатор», где в качестве катализатора могут выступать пероксидаза, гемо­глобин или соли металлов переменной валентности. Хемилюминесценция с люминолом получила широкое применение для регистрации дыхательного «взрыва» в фагоцитах [15], при этом с помощью небольших методических ухищрений можно добиться специ­
фичности метода именно для наработки Н202 [1079]. Чувствительность хемилюминес­центных методов с люминолом столь высока, что позволяет регистрировать перекись водорода в выдыхаемом воздухе [1061] и в отдельных фагоцитирующих клетках [372].

Гидроксильный радикал

Гидроксильный радикал ОН* является наиболее реакционным и «вредным» из АКМ, с его образованием часто связывается цитотоксическое и мутагенное действие АКМ в условиях окислительного стресса. ОН-радикал может разрывать любую С-Н- или С-С- связь, при этом скорость его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин, равных скорости диффузии (табл. 8); в результате чего время жизни ОН* в биологических субстратах по разным оценкам составляет от 2 х 109 до 8 х 109 с [848, 1011], а радиус миграции меньше 100 А, что сравнимо с размерами органических молекул. Другими словами, ОН* реагирует с первой попавшейся молекулой, без какой бы то ни было дискриминации.

Таблица 8

Константы скорости взаимодействия ОН-радикала с различными соединениями в водных растворах [14]

I Соединение Константа (М’с1) Соединение Константа (М 'с ') |
Каталаза 2,6 х 10" Дезоксирибоза 3,1 х 109
Гемоглобин 3,6 х 10ю Этанол 7,2 х І08
Сывороточный альбумин 2,3 х 10ю Лецитин 5,0 х 108
| Гуанин 1,0 х Ю10 Метанол 4,7 х 108
I Глутатион 8,8 х 109 Ре2+ 2,5 х 108
1 Фенол 4,2 х 109 О

X

4,5 х 108
I Тимин 3,0 х Ю9 Мочевина 7,0 х 105
[ Аскорбат 7,2 х 109

Образование ОН-радикала показано в реакциях окисления арахидоновой кислоты [242], при микросомальном окислении [68], в реакциях с флавиновыми ферментами [907], убихиноном [736] и пероксинитритом [1107], при взаимодействии гипохлорита с ионами железа [57], однако основным источником ОН-радикалов в большинстве биоло­гических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности (Ре2+, Си+, Со2+, Мп2+, V2*, Сг4+) [14, 869,908], главным образом Ре и Си+:

Н202 + Ре2+ > Ре 3+ + ОН* + ОН”

Реакция названа в честь кембриджского химика Генри Джона Хорстмана Фентона, который более 100 лет назад впервые показал высокую окислительную активность сульфата железа в комбинации с перекисью водорода (реактив Фентона) [347]. В даль­нейшем Габер и Вейс предположили [439], что эта высокая активность обусловлена об­разованием ОН-радикалов и показали, что для протекания реакции необходимо восста­
новление ионов Ее3+. Наряду с ионами железа в разложении перекиси водорода могут участвовать ионы других металлов переменной валентности, металлопротеины и ком­плексы ионов металлов с органическими молекулами [14, 408, 732, 869]. Важное значе­ние в биологических окислительных реакциях имеют ионы меди Си+ [225], которые в равных с ионами Бе2+ концентрациях значительно активнее последних в окислении ли­попротеинов или ДНК [122, 444].

В живых организмах восстановление Ее3+ возможно в реакции сО^:

Ре3+ + О > Ре2+ + 02,

а также при взаимодействии с аскорбиновой кислотой, глутатионом, цистеином и дру­гими легко окисляющимися соединениями [24, 152]. При наличии в среде и Н202 может протекать реакция Габера-Вейса:

э 02 + ОН" + ОН*,


О 2 + н2о2 > 02 + ОН" + ОН*

фактически протекающая в 2 стадии:

Н202 + Меп+ > Ме(п+1)+ + ОН* + ОН"

Ме(п+|)+ + О 2 > Меп+ + 02

Основными источниками каталитически активного железа, способного индуцировать разложение перекисей, в клетках являются ферритин, гемоглобин и микросомы. В фер- ритине клеточное железо запасается в окисленной форме (в виде Ре(ОН)3) и высвобож­дается под действием восстановителей [56]. В микросомах выявлен пул негемового же­леза, которое, как предполагается, служит для синтеза цитохром Р450-зависимых фер­ментов [693], при этом высвобождение ионов железа из микросом индуцируется гидроперекисью трет-бутила. В нормальных условиях в присутствии 0,25 мМ Н202 или других органических перекисей (гидроперекиси кумола и трет-§утила) из гемоглобина также наблюдается высвобождение каталитически активного железа [436]. Если при­нять, что концентрации Ре2+ и Н202 в клетке могут достигать 1 мкМ, то соответствую­щая скорость образования радикалов ОН* должна составлять 34 молекулы в секунду [56]. На самом же деле в нормальных условиях концентрации каталитически активных ионов металлов значительно ниже: так, содержание в сыворотке свободного Ре3+ и Ге2+ составляет 10'23 Ми 10'11 М, а бблыиая часть ионов находится в связанном с низкомоле­кулярными соединениями состоянии (1СГ11 М и Ю'10 М, соответственно); концентрация Си2+ в плазме составляет около 10 16 М, в комплексе с другими молекулами - 10‘9 М [168]. Не только свободные, но и связанные ионы металлов в комплексах с низкомоле­кулярными соединениями, такими как ЭДТА [513], а также в составе гемоглобина [805], миоглобина [806] могут участвовать в реакциях разложения органических перекисей с образованием ОН-радикалов.

Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые ор­ганизмы прямо связывается с генерацией ОН* в процессе радиолиза воды, на которую приходится основная масса большинства клеток и многоклеточных организмов [848]:

ОН* + Н+ + ё.

радиация
Н20

При радиолизе Н20 образуются также О 2, Н202, Н*, 102, Н2 и другие соединения, од­

нако исследования показывают, что выход этих продуктов существенно меньше, чем ОН-радикала. На 100 электрон-вольт поглощённой энергии ионизирующего излучения в водной среде в среднем образуется 2,8 частицы ОН*, 2,7 сольватированных электрона, 0,6 радикалов Н\ 0,7 молекул Н202, 0,45 молекул Н2 и значительно меньше других час­тиц [915]. Так как время жизни ОН-радикала мало, цитотоксический эффект действия радиации на культуральную среду незначителен по сравнению с облучением самих кле­ток [506]. Повреждения хроматина и ДНК, вызванные радиацией, по природе сходны с повреждениями, индуцированными перекисью водорода в присутствии ионов металлов переменной валентности [716, 1039].

Гидроксильные радикалы участвуют в микробицидном и цитотоксическом действиях гранулоцитов [834], моноцитов [734], Т-лимфоцитов [323]. При этом генерация ОН* стимулированными фагоцитами в очаге воспаления (рис. 11) и соответственно их цито­токсическое действие может существенно лимитироваться наличием в среде ионов же­леза [152, 860]. Гидроксильные радикалы вызывают повреждение ДНК, фибронектина, альбумина, других молекул и клеточных структур [445, 1027], ингибируют белки 05- фракции системы комплемента [1029], индуцируют образование органических радика­лов и таким образом запускают ПОЛ [68]. Считается, что цитотоксическое действие ки­слородных радикалов более чем на 50 % обусловлено ОН-радикалами [496], при этом в клетках выделяют два критических объекта повреждения: нуклеиновые кислоты [496] и мембранные белки [837]. Модификация оснований ДНК в результате действия ОН* при­водит, с одной стороны, к малигнизации поражённых клеток [310], а с другой - к обра­зованию аутоантител к трансформированной ДНК и индукции аутоиммунных процессов [103]. Помимо токсических, ОН-радикал обладает и косвенными регуляторными свойст­вами: например, участвует в активации тромбоцитов, индуцируя их агрегацию и про­дукцию ими тромбоксана А2 [504], служит триггером дифференцировки моноцитов ли­нии НЬ-60, индуцированной ФМА [1092], активирует растворимую гуанилатциклазу [301]. У спонтанно гипертензивных крыс линии БНКБР продукция ОН* в миокарде хо­рошо коррелировала со степенью гипертрофии левого желудочка и величиной развития некротических поражений миокарда после ишемии [33].

Высокие цитотоксичность и мутагенность гидроксильных радикалов делают акту­альным поиск средств защиты от них. Специфических ингибиторов, подобных СОД и каталазе, для ОН-радикала нет и не может быть ввиду высокой неспецифичности его взаимодействия с разными органическими молекулами и разными атомами в молекулах (табл. 8). Низкомолекулярные, легкоокисляющиеся соединения, такие как глутатион, урацил, мочевая кислота, маннитол, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, ингиби­руют ОН-радикалы и защищают биологические структуры, однако в таком качестве они эффективны только при достаточно высоких концентрациях [68, 406, 1011]. На роль от­носительно специфического биологического ингибитора ОН* предлагается эпифизарный гормон мелатонин, который действует более эффективно, чем глутатион и маннитол, см. Главу 2.

Так как основным источником образования гидроксильных радикалов в живых орга­низмах является реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, то снижение концентрации последних уменьшает и образование ОН*. В процессе эволюции в высших организмах выработались эффективные механизмы транспорта и запасания в

неактивной окисленной форме ионов железа и меди. Так, для транспорта железа в ткани у человека служит специальный белок трансферрин, при этом в сыворотке связано с ио­нами железа только 20-30 % железо-связывающих центров, в результате чего концен­трация Fe2+ и Fe3+ в плазме не превышает Ю'10 М [168]. Для запасания и хранения железа в клетках служит также уникальный белок - ферритин. Таким образом, не имея возмож­ности прямо инактивировать ОН-радикалы, живая природа разработала механизмы, препятствующие их появлению, однако эти механизмы не могут защитить организм от радикалов, образующихся при действии ионизирующей радиации.

Высокая реактивность и малые времена существования ОН-радикала в биологиче­ских системах создают определённые трудности его регистрации [445, 850]. Несмотря на то, что ОН* является радикалом, его измерение методом ЭПР затруднено малым вре­менем жизни; лишь недавно появились первые прямые измерения образования ОН- радикалов в реакции Фентона [274]. Для регистрации ОН* методом ЭПР предложено использование нескольких спиновых ловушек, однако их специфичность и возможность применения ставятся под сомнение [258, 790].

/ Возможно определение гидроксильных радикалов химическими методами по про- / дуктам реакций окисления и гидроксилирования (рис. 27). В качестве таких реакций I может использоваться окисление метионаля и его аналогов в этилен, /я/?ега-бутанола в ацетон и формальдегид, диметилсульфоксида с образованием метана, этана и формаль­дегида, а также стабильного продукта метансульфиновой кислоты; количественную оценку возникающих этилена, ацетона, формальдегида, метана и этана осуществляют с помощью газовой хроматографии [233, 258], метансульфиновую кислоту определяют колориметрически [788] или с использованием высокоэффективной жидкостной хрома­тографии [375]. Используется также декарбоксилирование меченой бензойной кислоты с выделением 14С02; гидроксилирование салициловой кислоты с образованием дигидрок- сибензоатов и катехола; деградация дезоксирибозы до карбонильных соединений, в ча­стности МДА psg, 7Л7, РЯД]

Предложен чувствительный и специфичный метод детектирования ОН-радикала, ос­нованный на измерении флуоресценции продукта гидроксилирования терефталевой ки­слоты [150]. Однако химические методы определения ОН* в биологических субстратах недостаточно чувствительны и специфичны, что можно продемонстрировать длительной дискуссией по поводу возможности генерации ОН-радикала фагоцитирующими клетка­ми [258,259, 1022].

Анализ образования ОН-радикалов в биологических системах дополнительно ослож­няется упомянутым выше отсутствием специфических ингибиторов, подобных СОД для О 2 или каталазе для Н202. Точнее, ингибиторов ОН* предложено много [233, 818, 1069], однако их действие эффективно только при высоких концентрациях, так как необходи­мо, чтобы на расстоянии радиуса своей диффузии (в биологических субстратах 15-30 А) ОН-радикал встретился с молекулой ингибитора. В таких высоких концентрациях мно­гие ингибиторы становятся токсичными для клеток, в силу этого обстоятельства они неприемлемы для исследований на биологических объектах (клетках, органах и целом организме).

В последнее время с успехом разрабатывается и применяется метод регистрации ОН- радикала in vivo, основанный на его взаимодействии с салицилатами, в результате кото­рого образуются 3 основных метаболита: катехол (11 %), 2,3-дигидроксибензоат (49 %) и 2,5-дигидроксибензоат (40 %) [345] (рис. 28), при этом 2,3-дигидроксибензоат - более специфичный маркер ОН-радикала, чем 2,5-дигидроксибензоат, который может синте­зироваться ферментативно цитохромом Р450. Данный метод используется следующим

образом: per os назначается определённое количество аспирина (2-гидроксибензойная кислота) и через 2-4 часа в крови измеряется содержание 2,3-ДИгидроксибензоата.

Для анализа продукции ОН-радикалов в тканях также может применяться техника микродиализа салицилатом натрия с последующим анализом образования

дигидроксибензойной кислоты [33].

CH3-S-CH2-CH2-CHO +*он Метиональ

1/2 (CH3S)2 + нсоон + сн2=сн2


Этилен

СН3-СН2-ОН +ЮН ►СНз-СН-ОН »-СНз-СНО

Этанол Ацетальдегид

С6Н5-14СООН + юн —► 14со2 + с6н5он

Бензойная кислота

Рис. 27. Принцип регистрации ОН-радикала химическими методами по продуктам реакций

окисления и гидроксилирования

Как обсуждалось выше, основным механизмом образования ОН* в биологических системах является разложение перекиси водорода, катализируемое ионами металлов переменной валентности (реакции типа Фентоновской), при этом необходимыми усло­виями генерации ОН* является наличие Н202 и восстановленных ионов металла. В этой связи для оценки цитотоксического и деструктивного действия ОН* важное значение имеет определение наличия в биологических субстратах и клетках металлов переменной валентности, особенно Ре2+_и Си+, а также их способности разлагать органические пере- I киси [14,36,475]. " ' ^

Оценка количества свободного железа в биологических системах может быть прове­дена посредством регистрации индуцированной Н202 биохемилюминесценции или хе­милюминесценции в присутствии люминофора [28, 67, 876], по образованию окрашен­ных комплексов с некоторыми хелаторами [14] или по высвобождению комплексами с блеомицином ТБК-реактивного материала из ДНК [438], методом ЭПР [14, 36]. Общее количество ионов Ре или Си может быть измерено методами колориметрии или атомно­адсорбционной спектрофотометрии [35, 76]. Исследования показали, что в тканях жи­вотных и человека концентрация каталитически активного железа может достигать 40 мкмоль на кг массы ткани [14]; при этом его основными источниками являются ферри-


Салицилуровая Салицилфенол- Салицилацил-

кислота глюкуронид глюкуронид

тин и пул негемового железа, связанного с микросомами [693]. Общее количество желе­за и величина его каталитически активного пула в сыворотке являются нестабильными параметрами и значительно изменяются как в течение суток, так и различаются в зави­симости от возраста и пола [76]. Большие вариации содержания железа в сыворотке ограничивают диагностическое значение его определения.

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Перекись водорода:

  1. ■ Хроническое отравление фтористым водородом и фтористыми солями
  2. Ферментативная активность.
  3. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ОБ АНТИСЕПТИКЕ И АСЕПТИКЕ
  4. Дыхательный взрыв
  5. ПЕРОКСИДАЗЫ
  6. КАТАЛАЗА
  7. ■ Интоксикация фтором и его соединениями
  8. ДЕЗИНФЕКЦИЯ
  9. ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА
  10. КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ СОСТОЯНИЕ
  11. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
  12. СИНТЕТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
  13. НОСОВЫЕ КРОВОТЕЧЕНИЯ
  14. КРОВОТЕЧЕНИЯ. НОСОВОЕ КРОВОТЕЧЕНИЕ