<<
>>

NO-синтазы

Образование N0* в организмах человека и животных происходит при ферментатив­ном окислении L-аргинина и показано во многих клетках и тканях [476, 703]. Синтез N0* осуществляется семейством уникальных цитохром Р450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (КФ 1.14.13.39, систематическое название «L-аргинин, НАДФН:кислород- оксидоредуктаза» (оксид-азота-образующая)), молекулы которых содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью.

NO-синтазы осуществляют пятиэлектронное окисление L-аргинина с образованием L-цитруллина и N0* (рис. 30). Иногда употреб­лявшийся ранее в литературе термин «NO-синтетазы» неверен, так как в реакции не ис­пользуются нуклеозидтрифосфатные коферменты (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ). По характе­ру индукции и действия ферменты разделяются на два класса:

кальций- и кальмодулин-зависимые, конститутивно экспрессируемые NO-синтазы, разделяемые на эндотелиальную (тип III) и нейрональную (I тип) изоформы; выявляются в эндотелиоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и других клетках (табл. 10), стимулируются физиологическими факторами или через рецепторы;

кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая NO-синтаза (тип II); найде­на в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах, её активность также выявляется в различных клеточных культурах и тканях (табл. 11); при активации транскрипции фермента цитокинами синтез N0* возрастает в десятки раз и максимальных значений достигает через часы [568, 703, 866].

Все 3 типа синтаз в качестве кофакторов используют НАДФН, ФАД, ФМН и тетрагидробиоптерин [476, 562]; спектр катализируемых реакций также во многом схож (табл. 12); альтернативными субстратами-ингибиторами синтеза оксида азота для них являются ^’-производные аргинина и ряд других соединений (рис. 31) [20, 60, 562, 702, 704]. Важное различие между изоформами NO-синтаз заключается в механизмах регу­ляции их активности в клетках [26]. Так, активность конститутивно экспрессируемых NO-синтаз эндотелиального и нейронального типов зависит от внутриклеточных кон­центраций ионов Са2+ и кальмодулина. В нейронах головного мозга глутамат, связыва­ясь с NMDA-рецепторами, открывает кальциевые каналы и повышает в клетках содер­жание Са2+, что в свою очередь активирует нейрональную NO-синтазу. В эндотелиоци- тах под действием вазоактивных соединений или сдвигового напряжения (shear stress) индуцируется выход ионов Са2+ из эндоплазматического ретикулума, что увеличивает активность эндотелиальной NO-синтазы. Ионофоры кальция или поликатионы (поли-L- лизин), способствуя росту концентрации внутриклеточного Са2+, усиливают активность конститутивно экспрессируемых NO-синтаз. Для регуляции индуцибельной NO-синтазы не требуются ионы Са2+, её активность повышается в результате стимуляции синтеза
мРНК, который контролируется фактором транскрипции №-кВ [585]. Активация КИ-кВ происходит в ответ на действие цитокинов (интерлейкин-1а, ФНО-а, ФНО-Р, интерфе- рон-у), липополисахариды или воздействия, повышающие продукцию АКМ в клетках.

Конститутивные Ж)-синтазы, выделяемые из клеток разных типов, по структуре во многом сходны между собой, но резко отличаются от индуцибельных изоферментов. Антисыворотка против Ж)-синтазы головного мозга взаимодействует с конститутивно экспрессируемыми ферментами из других клеток, в частности эндотелиоцитов, но не реагирует с индуцибельной ИО-синтазой, что указывает на их принципиальное различие [637]. Кроме того, показано, что ингибиторы Ж)-синтазы обладают разной эффективно­стью в отношении различных изоферментов: так, І^-нитро-Ь-аргинин в 300 раз более интенсивно ингибирует ЫО-синтазу мозга быка, чем ЫО-синтазу мышиных макрофагов [378]. Глюкокортикоиды супрессируют индуцибельную ИО-синтазу, но не влияют на активность конститутивных изоферментов [360].

Таблица 10

Ткани, органы и клетки, в которых выявлена конститутивно экспрессируемая ІМО-синтаза [26]

Клетки Ткани и органы
Эндотелиоциты Сосудистый эндотелий
Клетки эндокарда Центральная нервная система
Кардиомиоциты Периферическая нервная система
Мсгакариобласты Надпочечники
Моноциты/макрофаги линии 1774.2 Сетчатка
Нейтрофилы

Эритроциты

Тромбоциты

Клетки нейробластомы

Клетки гипофизарной линии вНЗ

Эпителиоциты почки

Тучные клетки

Мезангиальные клетки

Неадренергические нехолинергические нейроны

Скелетная мускулатура

Таблица 11

Клетки, клеточные культуры и ткани, в которых выявлена индуцибельно экспрессируемая

ЫО-синтаза [26]

Клетки Клеточные линии
Гепатоциты мыши, крысы, цыплёнка, человека RAW 264.7 мышиных макрофагов
Купферовские клетки мыши и крысы ЕМТ6 аденокарциномы мыши
Клетки мезангия мыши и коровы ТАЗ аденокарцинома мыши
Эндотелиоциты мыши и крысы J774 мышиных макрофагов
Клетки костного мозга мыши, крысы, быка, человека RFL-6 фибробластов крысы
Спленоциты мыши и крысы ЗТЗ линия фибробластов мыши
Гладкомышечные клетки мыши, крысы, кролика, свиньи, LA-4 линия эпителиоцитов лёгких
человека мыши
Пигментированные эпителиоциты сетчатки быка, человека Ткани

Клетки Ткани
Мезотелиальные клетки плевры крысы Лёгкие крысы
Фибробласты мыши и крысы Сердце крысы и человека
Нейтрофилы воспалительного экссудата мышей и крыс Печень мыши и крысы
Циркулирующие нейтрофилы человека Р-Клетки поджелудочной железы
Эозинофилы человека мыши, крысы, человека
Астроциты мышей и крыс Почка мыши и крысы
Моноциты/макрофаги мышей, крыс, быка, человека Кератиноциты мыши и человека Хондроциты кролика и человека Кардиомиоциты крыс и человека В Мегакариоциты и тромбоциты человека | Тучные клетки крыс I Клетки Сертоли крыс Ткань мениска колена человека

Активность Катализируемые реакции
Аргинин-Ы(0-гидроксилаза Аргинин + НАДФН + Н+ + 02 —> Гидроксиаргинин + НАДФ+ + Н20
I №3-Г идрокиаргинин- I монооксигеназа Г идроксиарганин + Уг (НАДФН + Нч) + 02 —> Цитру длин + N0* + Н20
НАДФН-диафораза* НСТ + НАДФН+ + Н+ -> Восстановленный НСТ + НАДФ+
Цитохром с-редуктаза* Цитохром с + НАДФН + Н+ —> Восстановленный цитохром с + НАДФ+
НАДФН-оксидаза* НАДФН + Н+ + 02 -> Н202 + НАДФ+
I Дигидроптеринредуктаза* ВН2 + НАДФН + Н+ -> ВН4 + НАДФ+

Таблица 12

Реакции, катализируемые ЬЮ-синтазами [562]

Примечание. * - Показано только для нейронального изофермента.




Нейрональная 140-синтаза представляет собой водорастворимый мономерный белок с молекулярной массой около 150 кДа, в её состав входят по 1 молю ФАД, ФМН и тет- рагидробиоптерина, каждая молекула содержит кальмодулин-связывающий центр, осу­ществляющий Са2+-зависимую регуляцию синтеза N0*, и атом железа, входящий в со­став гемовой простетической группы [680]; показана её существенная гомологичность цитохром Р450-редуктазе [476] и наличие НАДФН-диафоразной активности [290, 486], при этом последняя может быть использована в качестве маркера для конститутивных 140-синтаз [637], хотя существуют ложноположительные результаты [993].

140-синтаза эндотелиоцитов (тип III) несколько отличается от нейрональной изофор­мы фермента и представляет собой миристоилированный нерастворимый энзим с моле­кулярной массой около 135 кДа [378, 784], при этом мутация сайта 14- миристоилирования превращает эндотелиальную 140-синтазу из мембранного белка в цитозольный [862, 900], что приводит к снижению внеклеточной продукции N0* [862]. Хотя принцип регуляции активности конститутивных 140-синтаз схож, существуют вы­сокоспецифичные антитела, взаимодействующие только с нейрональным, но не эндоте­лиальным, изоферментом [637, 783], выявлены также различия в свойствах и ингиби- тор/субстратной специфичности [361, 562]. Проведённое клонирование и сравнение аминокислотных последовательностей конститутивных 140-синтаз из мозга и эндоте­лиоцитов показало, что они идентичны на 58-60 % [594, 783] и были, соответственно, идентичны на 51 % и 50 % индуцибельному изоферменту из макрофагов [1084]. Амино­кислотные последовательности индуцибельных 140-синтаз из человеческих и крысиных гепатоцитов, гладкомышечных клеток крысы и мышиных макрофагов были идентичны примерно на 80 %. По последним данным, деление на 3 типа не является окончатель­ным, ибо с помощью соматической гибридизации выявлено, что в геноме человека (в 17 хромосоме) присутствуют 3 гена, кодирующих гомологичные, но не идентичные по аминокислотной последовательности 140-синтазы II типа [176].

Основное место внутриклеточной локализации 140-синтаз - микросомы, однако фермент также выявляется в митохондриях клеток млекопитающих. Анализ с помощью специфических антител распределения бычьей эндотелиальной 140-синтазы в клеточных гомогенатах показывает, что более 80 % фермента локализовано в мембранной фракции, содержащей митохондрии и микросомы [400]. Выделенная из митохондрий гепатоцитов крыс 140-синтаза, по кинетическим параметрам, молекулярному весу и потребности в кофакторах идентичная индуцибельной 140-синтазе макрофагов, также взаимодейство­вала со специфическими антителами для индуцибельного изофермента [974]. Вместе с тем мембранная локализация (преимущественно на внутренней мембране митохондрий) и конститутивная экспрессия митохондриальной 140-синтазы позволили говорить об отличной от индуцибельной изоформе. Последующие исследования 140-синтаз из мито­хондрий печени крыс [332] и кардиомиоцитов мышей [529] с привлечением разных ме­тодов показали идентичность данного фермента нейрональной 140-синтазе. Предполага­ется, что в результате обратимой посттрансляционной модификации (ацетилирование и фосфорилирование С-концевых участков) нейрональная 140-синтаза приобретает спо­собность связываться с внутренней мембраной митохондрий [463]. Одновременная про­дукция в митохондриях N0* и О^, которые быстро взаимодействуют между собой с об­разованием пероксинитрита, приводит к тому, что средняя концентрация ОГЧОО- в ми­тохондриях составляет 2 нМ [1007]. Биологическое значение митохондриальной N0- синтазы остается не совсем ясным, анализ экспрессии и активности фермента в печени крыс в процессе эмбрионального развития и в течение 90 дней после рождения показал очень низкое содержание фермента в митохондриях зародышей и новорожденных кры­сят, в то время как по достижении животными взрослого состояния активность фермента возрастала более чем в 10 раз [230]. Полученные исследователями результаты позволили предположить, что митохондриальная NO-синтаза совместно с внутриклеточной Н202 регулируют переход печени от органа с высокой пролиферативной активностью (эм­брионы, новорожденные) к относительно стабильному (взрослые животные).

Из слюнных желез кровососущих насекомых (Rhodnius prolixus) был выделен фер­мент с молекулярной массой 185 кДа, предположительно идентичный конститутивной NO-синтазе [836]. Гемоциты моллюсков содержат конститутивный мембранный и инду- цибельный цитозольный ферменты, по способности генерировать нитриты, нитраты и цитруллин, зависимости от кальция и кофакторов, ингибированию L-NNA, Кт для L-аргинина и НАДФН-диафоразной активности сходные (хотя и не идентичные) с соот­ветствующими изоформами NO-синтазы млекопитающих [365]. Наличие индуцибельно- го фермента, по биохимическим и иммунным свойствам напоминающего NO-синтазу млекопитающих, выявлено даже у некоторых бактерий: Nocardia sp. [237], Helicobacter pylori от больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки [936], Staphylococcus aureus АТСС6538Р [245]. Таким образом, ферментативный синтез N0* представляет со­бой достаточно древний регуляторный процесс, трансформация которого в ходе эволю­ции привела к появлению в клетках млекопитающих целого семейства разных по свой­ствам NO-синтаз.

Таблица 13

Физико-химические и функциональные характеристики NO-синтаз человека [59, 472]

Характерне- Изоформа NO-синтазы
I тика нейрональная эндотелиальная индуцибельная
Синонимы NOS I; nNOS; ncNOS; bNOS NOS III; eNOS; ecNOS NOS II; iNOS: macNOS
Преимущест­венная лока­лизация Нейроны,

скелетные

мышцы

Эндотелиоциты, эпителиоциты, кардиомио­циты, тромбоциты, нейроны Макрофаги, гладко­мышечные клетки, гепатоциты ...
Молекулярная

масса

161 кДа 131 кДа 133 кДа
Количество

аминокислот

1429 1203 1153
І Локализация в I клетке Цитоплазма, комплекс Г ольджи Мембраны, цитоплазма (комплекс Гольджи, кальвеолы) Цитоплазма, фаго- сомы
[Хромосомная [ локализация 12q2 4.2-31 7q35-36 17ql 1.2-12
Структура и размер гена 29 экзонов, 28 интронов;

> 200 тыс.п.о.

26 экзонов, 25 интронов; 37 тыс. п. о. 26 экзонов,

25 интронов; 21-22 тыс. п. о.

Активаторы/

индукторы

Г лугам ат,

N-Memn-D-

аспартат

Субстанция Р, АДФ, АТФ, ацетилхолин, адено­зин, брадикинин, серотонин, холецистокинин, эндотелии, гистамин, тромбин, лейкотриены, ионофоры Са2+, олеиновая кислота, фактор активации тромбоцитов, кальцитонин; сдвиго­вое напряжение; изменение интенсивности пульсации, скорости кровотока и р02 крови Цитокины (интер­лейкин- 1р, ФНО-а, ФНО-Р, интерфе- рон-у), липополи- сахариды, у-излучение, цис- платина

Специфические для разных тканей и клеток NO-синтазы в настоящее время доста­точно хорошо изучены, определены их молекулярные массы (125-160 кДа), первичные структуры белков и нуклеотидные последовательности соответствующих генов, уста­новлена хромосомная локализация генов, кодирующих NO-синтазы [562] (табл. 13). Вместе с тем данный вопрос нельзя считать закрытым: так, из гепатоцитов выделена и описана индуцибельная NO-синтаза, рекомбинантная ДНК которой имела нуклеотидную последовательность, на 80 % гомологичную макрофагальной NO-синтазе и на 50 % - синтазам из эндотелиоцитов и нейронов. Данный фермент имел уникальные свойства, характерные как для индуцибельных (индуцируется комбинацией факторов: ИЛ-1, ФНО, интерферон у и липополисахарид), так и для конститутивно экспрессируемых NO-синтаз (регулируется Са2+/кальмодулином) [644].

Синтез NO0 фагоиитируюшими клетками

Впервые способность активированных липополисахаридом макрофагов мыши синте­зировать нитрат и нитрит была показана Stuehr и Marietta в 1985 году [952]. В дальней­шем было установлено, что метаболиты N0* образуются в результате индукции в клет­ках синтеза кальций-независимой NO-синтазы. Образование N0* макрофагами стиму­лируется бактериальными липополисахаридами, а также лимфокинами Т-хелперных лимфоцитов типа 1, - такими, как интерлейкин-2, IFN-y (но не IFN-ctP [344]) или его комбинации с TNF-a, TNF-P, липидом А [96, ПО, 344, 520, 653], при этом отмечается, что если генерация 0~2 и Н2О2 происходит через несколько минут после стимуляции клеток, то окислы азота синтезируются через часы [658, 666]. Выявлена индукция синте­за N0* в нестимулированных клетках Купфера крысы при их совместной культивации с клетками гепатомы dRLh-84, причём не только с цельными, но и с мембранными препа­ратами; аналогичный эффект наблюдался в перитонеальных макрофагах при их совме­стной инкубации с клетками тимомы BUT-T и базофильной лейкемии RBL-2H3 [116]; опухолевыми клетками культур L929 и Уас-1 [913].

Наличие индуцибельной NO-синтазы не является прерогативой только фагоцити­рующих клеток (табл. И). Считается, что «синтез индуцибельной NO-синтазы в макро­фагах и других клетках - основа неспецифической резистентности» [703]; вещества, стимулирующие неспецифический иммунитет (эндотоксин, мурамилдипептид, моно- фосфорил липида А в комбинации с димиколятом трегалозы), дозозависимо стимулиро­вали кальций-независимую NO-синтазу лёгких у мышей, в отличие от соединений, не­способных индуцировать неспецифическую резистентность (монофосфорил липида А и димиколят трегалозы по отдельности) [758]. Индукция NO-синтазы в тканях крыс пока­зана также при адаптации к стрессовым воздействиям [50].

После стимуляции мышиных макрофагов интерфероном-у в смеси с липополисаха­ридом максимум синтеза N0* наблюдается через 12 часов, к 72 часам наработка N0* снижается до начального уровня и может быть вновь реактивирована, повторная актива­ция связана с экспрессией синтеза мРНК NO-синтазы [279]. На мышиных гепатоцитах выявляется наличие синергизма действия цитокинов, индуцирующих экспрессию NO- синтазы: комбинация липополисахарид + интерферон-у + ФНО-a + ИЛ-1 в сотни раз более эффективно повышала содержание мРНК NO-синтазы и синтеза N0*, чем каждый из индукторов по отдельности [389]. Аналогичный синергичный эффект интерферона-у, липополисахарида или ИЛ-1р показан для лёгочных фибробластов крыс [516]; ИЛ-1р, ФНО-a и ИЛ-17 синергично усиливали продукцию N0* в ткани мениска колена челове­ка [612]. В клетках макрофагальной линии ANA-1 липополисахарид и интерферон-у по

отдельности не индуцировали ни синтез N0, ни экспрессию мРНК индуцибельной N0- синтазы, а их совместное применение вызывало существенную активацию обоих про­цессов [906].

В то же время разнесение индукторов во времени может приводить к парадоксаль­ным результатам: длительная (16 ч) предынкубация мышиных макрофагов с низкими дозами липополисахарида и липида А ингибировала последующую стимуляцию N0- синтазы в ответ на инкубацию с интерфероном-у [179]. То есть предактивация путей, в норме участвующих в синергической индукции NO-синтазы, может истощать в макро­фагах факторы, необходимые для её экспрессии. Кроме того, разные цитокины воздей­ствуют на разные стадии процесса, приводящего к индукции NO-синтазы. Так, в работе [239] показано, что при совместно-последовательной инкубации мышиных макрофагов с интерфероном-у, липополисахаридом, мурамилдипептидом и интерлейкином-1 интер- ферон-у необратимо действует первым, а три последних цитокина необходимы постоян­но для последующей транскрипции гена NO-синтазы. Существуют интересные данные о том, что воспалительные цитокины могут действовать как триггеры, переключающие синтез N0* с конститутивного на индуцибельный: интерферон-у, как и липополисаха- рид, дозо- и время-зависимо ингибировал продукцию оксида азота конститутивной N0- синтазой, в то же время вызывая классическую индукцию NO-синтазы II типа в клетках линии сосудистого эндотелия мыши sendl, экспрессирующих оба изофермента [1033].

Ряд цитокинов, таких как интерлейкин-4 [110, 235], интерлейкин-8 [742], интерлей- кин-10 [235, 280], интерлейкин-13 [313], факторы роста фибробластов [416], росттранс- формирующие факторы pi, р2, рЗ и макрофаг-деактивирующий фактор [308, 653], а также простагландин Е2 [454], глюкокортикоиды [389] обладают супрессирующим эф­фектом в отношении индукции NO-синтазы и индуцибельного синтеза N0*. В то же время показано опосредованное стимулирующее влияние интерлейкина-10 на генерацию N0* макрофагами, индуцированную комбинацией IFN-y с липополисахаридом [241] или TNF-a [270]. Такое неоднозначное действие интерлейкина-10, по-видимому, связано с его способностью ингибировать синтез эндогенного TNF-a, который усиливает индуци­рующее действие интерферона-у [749].

Выявлено также необратимое ингибирование активности NO-синтазы оксидом азота, что позволило предположить наличие обратной (feedback) регуляции по конечному про­дукту [124]; аналогичный феномен обнаружен также и в отношении эндотелиальной NO-синтазы [212, 823]. Предполагается, что N0* связывается с гемом фермента и тем самым снижет его активность и/ил и ограничивает димеризацию индуцибельной изо­формы, предотвращая включение гема в её состав [104], при этом тетрагидробиоптерин, действуя как нестехиометрический восстановитель редокс-активного компонента фер­мента, предотвращает связывание N0* с его гемовой частью [492]. Возможен и другой механизм: под действием оксида азота происходит S-нитрозилирование и обратимая деструкция тетратиолятного кластера NO-синтазы, обеспечивающего взаимодействие её мономеров, в результате чего фермент переходит из димерной формы в мономерную и инактивируется; денитрозилирование и восстановление каталитически активной струк­туры NO-синтазы осуществляется тиолами, в частности, тиоредоксином и тиоредоксин- редуктазной системой [822]. Ретроградная регуляция фермента может выполняться так­же путём ингибирования оксидом азота транскрипции мРНК NO-синтазы либо непо­средственно [769], либо через угнетение активации jIF-кВ [261]. Интересной особенностью этой регуляции является её зависимость от концентрации N0*: при добав­лении небольшого количества экзогенного N0* индукция мРНК NO-синтазы комбина-

дней липополисахарид + интерферон-у существенно увеличивалась, в то время как в 100 раз большие концентрации N0* оказывали ингибирующий эффект [906]. Своеобразным способом ингибирования NO-синтазы II типа является обнаруженный в мышиных мак­рофагах феномен одновременной индукции липополисахаридом этого фермента и арги­назы, конкурирующей с ним за субстрат, при этом транскрипция ферментов осуществ­ляется по разным механизмам [1037]. Более того, показано, что эффект росттрансфор- мирующего фактора р [191] и некоторых других ингибиторов NO-синтазы (интерлейкин-4, интерлейкин-10, простагландин Е2) [271] также отчасти обусловлен ин­дукцией ими аргиназы. Обратная регуляция индуцибельной NO-синтазы оксидом азота может осуществляться также через ингибирование ЛПС-стимулированного синтеза ин­дукторов фермента, интерлейкина-1 и интерлейкина-6 [777].

Особое внимание фокусируется на свойствах N0* как антимикробной и противоопу­холевой эффекторной системы мононуклеарных фагоцитов, активной в отношении гри­бов [418], бактерий [479, 957], вирусов [651, 684], паразитов [384], опухолевых клеток [622] и некоторых чувствительных клеток собственного организма, таких как р-клетки поджелудочной железы [580]. Цитотоксическое действие N0* проявляется в отношении как внеклеточных (Schistosomula или Shistosoma mansoni, Salmonella typhymurium, Naegleria-fowleri amoebae, T. musculi), так и внутриклеточных объектов (Leishmania major, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Legionella pneumophila, Mycobacterium leprae, M. tuberculosis, M. avium, M. bovis, Cryptococcus neoformans, Listeria monocytogenes) [166, 353, 384, 422, 609, 713, 957]. Данный эффект связывается с нитро- зилированием железосерных групп в активных центрах ферментов, включая такие жиз­ненно важные энзимы, как аконитаза в цикле Кребса, комплексы I и II митохондриаль­ной цепи переноса электронов (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза, сукцинат-убихинон- оксидоредуктаза) в опухолевых клетках [316, 588] или Fe-СОД в бактериях [726], а так­же S-H содержащих групп в белках, в том числе цистеиновых протеазах [260] (табл. 14). Антивирусный эффект N0* опосредован ингибированием репликации вируса и проявля­ется на уровне синтеза ДНК [684]. Многие бактерии и микроорганизмы имеют доста­точно эффективную защиту от Oj, образующегося при активации НАДФН-оксидазы,

главным элементом которой является Fe-СОД, поэтому считается, что наработка N0* позволяет фагоцитам преодолеть данную систему защиты.

Ингибирующее или активирующее действие N0* на активность ферментов определя­ется способностью радикалов взаимодействовать с ионами металлов переменной ва­лентности в активных центрах. Скорость реакции взаимодействия N0* с цитохром с ок- сидазой аналогична таковой для 02 (k = 1 х 108 M'V1), менее эффективно NO-радикалы взаимодействуют с гемоглобином (к = 2 х 107 M'V1), однако они более эффективно по сравнению с 02 взаимодействуют с миоглобином (к = 1,7x107 M'V1) [267]. С железом в составе гема N0* образует комплексы как в восстановленной (Fe2+), так и в окисленной (Fe34) форме:

NO* + Fe2+ < > Fe2+-NO*

NO* + Fe3+ < > Fe2+-NO+

Такие комплексы очень нестабильны и быстро диссоциируют. Поэтому, как правило, ингибирование N0* активных центров ферментов носит обратимый характер. Вместе с тем в физиологических условиях, в присутствии 02, Н20 и ОН”, распад комплексов N0* с ионами железа может приводить к образованию окислов азота или пероксинитрита:

Fe2+-NO' + 02 > Fe3+ + ONOCT

Ре2+-Ш+ + ОН“ » Ре2+ + N0 ~ + Н+

Ре2+-ИО+ + Н20 > Ре2+ + N0^+ 2Н+

Таким образом, фактически и окисленные (Ре3+), и восстановленные (Ре2+) ионы же- пеза как в связанном с белками, так и в свободном виде катализируют метаболизм N0* в окислы азота.

Прямое действие N0* на активность ферментов

Таблица 14

Фермент Ссылка Фермент Ссылка
Ингибирование Активация
Аконитаза 316 Г уанилатциклаза 742
НАДН:убихинон-оксидоредуктаза 316,588 АДФ-рибозилтрансфераза 742
Сукцинат: убихинон-оксидореду кт аза 316,588 Циклооксигеназа 268, 868
Рибонуклеотидредуктаза 590, 621 Активатор плазминогена 526
НАДФН-оксидаза 251
5-Липоксигеназа 530
Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа 701
Супероксиддисмутаза 726
Г лутатионредуктаза 373
Глутатион пероксид аза 123
ІДитохром Р450 692,

1065

Ыа\К+-АТФаза 881
ДНК-лигаза 419
Каспаза-3 652
Ксантиноксидаза 374

Микробицидное или цитотоксическое действие N0* может во многом зависеть от об­разования оксидов азота: нитрита (N0^), нитрата (N0") и пероксинитрита (ОГЮСТ)

[658, 726]. В физиологических условиях N0* взаимодействует с молекулярным кислоро­дом с образованием ряда интермедиатов, которые в водных растворах разлагаются на стабильные анионы N0 ~2 и N0 ~:

2Ш* + 02 >2ГЮ*2

2Ж)2’ Ы204 НЮ > N0“ + ИОз + 2Н+

N0/ + ^04 —1- Ю ) N0* + 2N0~ + 2Н+ N0’ + N02* N203 Нг° > 2N0 “ + 2Н+

Высокой токсичностью обладает пероксинитрит, который образуется в реакции N0* с супероксид-анионом:

О 2 +N0* >(ЖОСГ

Константа скорости этой реакции по одним данным составляет (3,7 ± 1,1) х 107 М^с'1 [875]; по другим данным, полученным методом импульсного фотолиза, константа ско­рости значительно выше - (6,7 ± 0,9) х 109 М^с"1 [489] или еще выше (1,6 ± 0,3) х Ю10 М' V1 [556]. Близкие к последним значения получены с помощью метода импульсного ра­диолиза - (4,3 ± 0,5) х 109 М^с1 [407] или 4 х 109 М^с1 [556], при этом скорость реакции не зависела от ионной силы и pH в области 6,1 -г- 10,0. Соотношение поглощения кисло­рода, образования О 2 и окислов азота резидентными и стимулированными альвеоляр­ными макрофагами крысы представлено в табл. 15. Как видно из таблицы, образование окислов азота наблюдается в альвеолярных макрофагах даже в отсутствие стимуляторов. Есть предположение, что синтез N0* необходим для создания микробицидного потен­циала лёгких [502].

Таблица 15

Поглощение 02 и наработка О 2, N0 2, N0 3 и ОЫОСГ альвеолярными макрофагами крысы (нмоль х 106 клеток/мин) в норме и при стимуляции ФМА в присутствии и отсутствии ингибитора

ЫО-синтазы Ь^ММА [502]

Макрофаги + ФМА
- Ь^ММА + Ь^ММА
Поглощение кислорода 1,28 ± 0,11 1,9610,20 1,71 ±0,20
Образование 0 2 ~0 0,3710,04 0,4910,04
Образование N0 ~2 + N0 3 0,06 ±0,01 0,1010,01 0,00310,001
% N0 з в (N0 2 + N0 з) 35±11 % 6217 % -
Образование (ЖОО ~0 0,1210,02 ~0

N0 2 и N0 з - сильные окислители; их цитотоксичность в отношении Е. соИ значи­тельно возрастает при низких pH и в присутствии перекиси водорода и миелопероксида- зы; вместе с тем нитрит снижает микробицидное действие гипохлорита в системе Н202- МПО-СГ [560]. Оксиды азота могут ингибировать ДНК-лигазу, необходимую для вос­становления целостности ДНК в процессах транскрипции и репарации [419].

Г Среднее время жизни пероксинитрита в фосфатном буфере при pH 7,4 и 37 °С со- \ ставляетТ-2 с, в физиологических условиях он находится в равновесии с пероксиазоти- стой кислотой (рКа = 6,5-6,8), может мигрировать в тканях и легко проникает через мембраны (коэффициент проницаемости 8х10'5м/с) [657]. Пероксинитрит - сильный окислитель, способный окислять~Г4Н2- и БН-группы белков [812], что приводит, в част- / ности, к инактивации а!-ингибитора протеиназ [706], тканевого ингибитора металлопро- | теиназ-1 [366], Мп-СОД и Бе-СОД [503]; СЖОСГ способен индуцировать процессы ПОЛ

в мембранах [811], вызывать однонитевые разрывы [864] и резко повышать образование 8-гидроксидезоксигуанозина в ДНК [501], гидроксилировать и нитровать ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан) в составе белков [112, 660], ингибировать митохон­дриальное дыхание [965] (в том числе и опосредованно - в результате активации no-^j ли(АДФ-рибоза)полимеразы, репарирующей повреждённую пероксинитритом ДНК [966, 1026]). В концентрации 250 мкМ он вызывает пятидесятипроцентную гибель бак­терий Е. coli [1107]; под действием ONOCT (1-100 мМ) погибают опухолевые клетки линий HL-60 и U-937 (но не нормальные моноциты и эндотелиоциты), причем путём классического апоптоза: с деградацией и фрагментацией ДНК, конденсацией хроматина и фрагментацией ядра [631]. Апоптоз клеток PC 12, в которых репрессирована Cu,Zn- СОД, также опосредован образованием больших количеств ONOCT [994].

Пероксинитрит выполняет и физиологические функции: например, ингибирует и об­ращает агрегацию тромбоцитов, причём не за счёт конверсии в NO*, а скорее через нит­рование белков, которые в результате приобретают антиагрегационные свойства [1094]. Прямо ONOO" гуанилатциклазу не активирует, однако в присутствии глутатиона и ио­нов меди образуется тионитрит (GSNO), который, разлагаясь, образует свободные NO- радикалы, инициирующие синтез цГМФ [668].

Существенный вклад в цитотоксическое действие пероксинитрита вносит образую­щийся из него в результате нефентоновской реакции при понижении pH ОН-радикал [356, 484, 572]. Данная реакция не требует участия металлов переменной валентности, , содержание которых в клетках в свободном виде мало, кроме того, скорость взаимодей­ствия О 2 с NO* выше, чем с СОД, поэтому некоторые исследователи считают, что это одна из основных клеточных реакций, приводящих к образованию гидроксильного ра­дикала [367].

ONOO" + Н+ > ONOOH > НО* + N02* (выход 20-30 % [367])

ONOOH > Н+ + NO з.

Вместе с тем в биологических системах нельзя прямо связать продукцию Oj и NO* с образованием ОН-радикалов, так как N0* модулирует активность реакции Фентона с участием металлосодержащих комплексов и гемовыми протеинами [426]. Гидроксили- рование бензойной кислоты ОН-радикалами, образующимися в реакции О 2 и Н202 с комплексами Ре3+-ЭДТА, ингибируется NO-радикалами. По-видимому, такое ингибиро­вание происходит в результате образования нитрозильных комплексов с ионами железа:

Ре3+-ЭДТА + О “ » Fe2+-3flTA + 02

Fe2+-3ATA + N0* > NO-Fe2+-3flTA

NO-Fe2+-3flTA + H2 Fe3+-3flTA + HN02 + OH"

Поэтому в низких концентрациях N0* усиливает, а в высоких подавляет образование ОН-радикалов в реакции Oj и Н202 с метгемоглобином. Некоторые исследователи ста­вят под сомнение возможность распада пероксинитрита с образованием радикалов НО* и N0^ в физиологических условиях. Дело в том, что во многих клетках - от прокариоти­ческих (бактерии) до клеток млекопитающих - выявляется пероксинитритредуктазная активность, в результате которой основная часть пероксинитрита и N0* трансформиру­ется в нитрит (ONOO" + 2Н+ + 2ё —> N0 ~2 + Н20). Такую активность проявляет глутати- онпероксидаза, для которой константа скорости восстановления ONOO“ при pH 7,4 и 25 °С составляет (8,0 ± 0,8) х 106 М'V1, при этом эффективность взаимодействия окис­
ленной формы глутатионпероксидазы с пероксинитритом ниже на порядок, к = (0,7 ± 0,2) х 106 M'V1 [197]. Наличие пероксинитритредуктазной активности у цито­хром с-оксидазы на комплексе IV цепи переноса электронов (константа взаимодействия пары «гем аз-Cu/ с ONOCT ~ 106М'1с'1) позволяет предположить, что в богатых мито­хондриями клетках (кардиомиоциты мышей) основная часть N0* (85 %) вначале окисля­ется до ONOCT, в последующем восстанавливаясь до NO2 [773]. Пероксиредоксины из вирулентных штаммов бактерий (Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori) проявляют достаточно высокую пероксинитритредуктазную актив­ность (константы реакций катаболизма ONOCT - 1,3 х 106 M'V1), что помогает бактери­ям противостоять токсическому действию фагоцитов [210]. Пероксидазы бактерий, ко­дируемые геном catG, а также пероксиредоксин алкилгидропероксидредуктазы С (ген ahpC) in vitro также проявляли пероксинитритазную и пероксинитритредуктазную ак­тивности [210, 1048].

Предполагается, что образование 3-нитротирозина и дитирозина в результате реак­ции тирозина (или его остатков в белках) с ONOCT происходит под действием интерме­диата декомпозиции ONOOH - радикала N02* [530]. При взаимодействии пероксинит- рита с гидроперекисью третбутила также показано образование синглетного кислорода [304].

N0* может служить источником возникновения не только пероксинитрита и ОН- радикала, но и синглетного кислорода, который образуется при взаимодействии оксида азота с перекисью водорода (но не с супероксид-анионом) [739]. Возможно, этим можно объяснить усиление токсичности N0* перекисью водорода в отношении эндотелиоцитов [1030] и опухолевых клеток [342] (О ~2 таким эффектом не обладал). Кроме того, показа­но усиление перекисью водорода антиагрегационного действия оксида азота, которое не было обусловлено образованием пероксинитрита и не ингибировалось ловушками ради­калов [724]. При инкубации ферритина с донорами NO-радикалов (нитропруссид на­трия) наблюдалось высвобождение ионов железа и усиление процессов ПОЛ [831].

Взаимодействие пероксинитрита с глутатионом приводит к образованию тиильных радикалов глутатиона (GS*), в результате чего последний из антиоксиданта может пре­вращаться в прооксидант, инициирующий ПОЛ [537]. Кроме того, окисление перокси­нитритом глутатиона инициирует развитие ряда реакций, приводящих к снижению уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона:

к3 = 103 - 104 M'V1

GSH + ONOO' — ► GS* + NO*+ H0‘

к]j = 2 г 109 M'V1

GS* + 02 ia- GSOO*

k-]] = 6,2 г 105 c'1

GSSG*


GSOO* + GSH ► GSOOH + GS*

Масс-спектрометрические исследования показали, что важным продуктом взаимо­действия пероксинитрита с глутатионом является Б-нитрозоглутатион (GSN02), который в физиологических условиях находится в протонированной форме (С8Ж)2Н^ и может

разлагаться с образованием свободного N0* [139]. В присутствии С02 пероксинитрит образует нитрозопероксокарбонат (ОЖЮСО^), способный эффективно нитровать ами­нокислотные остатки белков [466]. ^

Цитотоксическое действие N0*, подобно действию других форм АКМ, не ограничи­вается чужеродными клетками и может проявляться в отношении собственных клеток и тканей организма. Как показали витральные эксперименты с различными клеточными культурами, наиболее подвержены деструктивному действию N0* [3-клетки островков Лангерганса, дисфункция и деструкция которых свободными радикалами, и главным образом - N0*, является ключевым звеном развития инсулин-зависимого диабета [650]. Источником образования N0* в этом случае являются макрофаги [580, 650] и собственно (3-клетки [743], при этом усиление цитотоксического эффекта наблюдается при индук­ции синтеза N0* и экспрессии индуцибельной 140-синтазы этими клетками под действи­ем цитокинов [953] (особенно лимфоцитарного интерлейкина-1(3 [743, 1080] через по­средство в-белков [808]); непосредственной мишенью - ДНК островковых клеток [581]. ( Возможно также, что N0* вмешивается в регуляцию высвобождения инсулина глюко­зой, ингибируя активность фосфофруктокиназы и тем самым открывая АТФ- чувствительные калиевые каналы [995]. Кроме того, оксид азота способствует пролонга­ции воспалительной реакции в островках Лангерганса, активируя индуцибельную цик­лооксигеназу и, таким образом, усиливая генерацию простагландина Е2 [268]. В то же время показано, что в низких концентрациях N0* может стимулировать секрецию инсу­лина (3-клетками через деэнергизацию митохондрий и, таким образом, увеличение цито­зольного кальция [592].

Результаты последних исследований позволили предположить, что активация N0- синтазы может являться причиной гибели макрофагов [105, 877], костномозговых пред­шественников [643], тимоцитов [346], клеток поджелудочной железы [686], миобластов скелетных мышц [941], клеток корковых нейронов [762], гладкомышечных клеток [376], саркомы М5076 посредством апоптоза [1083]. На опухолевых линиях ЯА\¥ 264.7 (мак­рофаги) и КН4т5Р (клетки поджелудочной железы) показано, что этот эффект N0* опо­средован стимулированием им экспрессии проонкогена р53 [686]; эксперименты с клет- I ками линии лейкемии человека НЬ-60 выявили участие активации поли(АДФ- рибоза)полимеразы в индуцированном N0* апоптозе [586]. Существует также мнение, что одной из основных мишеней N0* при развитии апоптоза являются митохондрии, а именно их мембранный потенциал, ведущая сила синтеза АТФ [839]. В то же время ^ инактивация 140-синтазы В-лимфоцитов человека, напротив, усиливала их апоптоз [651]; дегенерация яичниковых фолликулов, протекающая по апоптотическому меха­низму, предотвращается интерлейкином-1(3 через повышение синтеза N0* [249]; на апоптоз каррагинан-элиситированных перитонеальных нейтрофилов, продуцирующих N0, не влияли ни его доноры (БЫАР), ни ингибиторы 140-синтазы (Ь-Г4ММА, Ь-14Ю) [350].

Необходимо отметить, что в начале эры N0* эксперименты по индукции цитокинами синтеза оксида азота макрофагами мышей и крыс не воспроизводились на макрофагах некоторых других видов животных, в том числе человека (табл. 16) [477, 888]; прове­дённое с помощью иммунофлуоресцентного анализа исследование содержания разных изоформ 140-синтаз в клетках человека также не выявило наличия индуцибельной фор­мы фермента в нейтрофилах, хотя в эозинофилах она обнаружена (табл. 17) [1032]. Это позволяло исследователям утверждать, что фагоциты человека не экспрессируют инду­цибельную 140-синтазу, и даже ставить под сомнение участие N0* в противомикробном

действии фагоцитов человека. В то же время на сегодняшний день опубликовано более 200 работ, свидетельствующих о наличии мРНК и белка индуцибельной NO-синтазы в мононуклеарах человека [318, 1040, 1108], хотя их содержание и уровень индуцируемой цитокинами продукции N0*, как правило, невелики [1041]; обнаружен фермент и в ней­трофилах человека [234], показано существенное повышение его экспрессии при остром инфаркте миокарда [870], инфекциях [1055]. Причиной противоречивости полученных экспериментальных данных может служить недостаточное понимание сигналов, кото­рые необходимы для активации индуцибельной NO-синтазы в клетках человека. Так, практически все исследования, выполненные на макрофагах, полученных от пациентов с инфекциями или другими воспалительными заболеваниями, свидетельствуют об экс­прессии клетками фермента, в то время как макрофаги, дифференцировавшиеся in vitro из моноцитов крови здоровых людей, индуцибельную NO-синтазу, как правило, не со­держат [339]. Промоторы генов фермента в макрофагах человека и грызунов существен­но различаются [978], и проблема изучения генерации N0* человеческими мононуклеа- рами, очевидно, требует дальнейших исследований транскрипционной регуляции инду­цибельной NO-синтазы в этих клетках.

Таблица 16

Межвидовые и межклегочные различия генерации нитрита N0 2 (мкмоль/106 клеток/день) макро­фагами [888]

Стимулятор
Мононуклеарные фагоциты
0 ЛПС ИФН-у ИФН-7 + ЛПС ИФН-7 + ЛПС + ВН4
Моноциты крови человека
<< | >>

Еще по теме NO-синтазы:

  1. УПРОЩЕННАЯ МОДЕЛЬ ДЕЙСТВИЯ КОРТИКОСТЕРОИДОВ
  2. Нормальний синтез андрогенів
  3. Митохондриальные болезни (болезни дыхательной цепи митохондрий)
  4. Ефекти ІАПФ
  5. ФАРМАКОГЕНОМИКА И БИОИНФОРМАТИКА
  6. КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450
  7. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ CYP450, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
  8. ТРОМБОЦИТАРНО-СОСУДИСТЫЙ ГЕМОСТАЗ
  9. Роль витаминов в системе клеточного метаболизма
  10. Юрий Андреевич Андреев. Три кита здоровья СПб.:,1994. — 382 с., 1994
  11. Предисловие к 14-му официальному изданию (неофициальных, воровских было без счету)