<<
>>

Супероксиддисмутаза. Изоформы, структура, распространение

В 193.8 году из крови вола был выделен и описан сине-зелёный белок с молекулярной \ массой около 35 кДа. Белок не проявлял ферментативной активности, Тно связывал ионы меди, и был назван гемокупреином (по названию ткани, из которой был выделен).

Затем из других тканей были получены аналогичные белки: цереброкупреин (из мозга), эрит­рокупреин (из эритроцитов), гепатокупреин (из печени). Обработка данных белков сульфатом аммония позволяла выделить бесцветный апопротеин, который при добавле­нии CuS04 связывал ионы меди и вновь приобретал окраску; это послужило основой предположения, что купреины служат для связывания меди в тканях. В последующем были подробно изучены физико-химические свойства данных белков и выяснилось, что эритрокупреин человека идентичен гепатокупреину и цереброкупреину, кроме того, ку­преины человека проявляли перекрестную серологичную реактивность с белками из тканей обезьяны. Было также показано, что помимо ионов меди белки связывают ионы Zn2+.

В 1969 году, изучая супероксид-ингибирующую активность различных субстратов,г Мак-Корд и Фридович [1005] впервые описали супероксиддисмутазуДКФ 1.15.1.1, сис­тематическое название "супероксид:супероксидюксидоредуктаза''), которая оказалась идентичной эритрокупреину. В последующем выяснилось, что СОД имеет несколько изоферментных форм, отличающихся строением активного центра. Структура и свойст­ва разных изоформ СОД в настоящее время всесторонне изучены [123, 593]. Вкратце можно отметить, что нативные ферменты высокоустойчивы и выдерживают нагревание при 100 °С в течение 1 мин, а также устойчивы к колебаниям pH в широком диапазоне (от 2 до 12) [123, 1610], хотя есть данные, что инкубация в течение 120 мин при pH 5,9 ] приводит к полной инактивации фермента [32]. В 86-процентном этаноле СОД сохраня­ет 90 % своей активности в течение 3 часов.

Разные формы СОД принято классифицировать по строению активного центра iT структурной организации молекул. В организмах млекопитающих выявляются 3 основ­ные изоформы СОД: медь-цинковая (Cu,Zn-COfl; СОД1), марганцевая (Mn-СОД; СОД2) и экстрацеллюлярная (Э-СОД; СОДЗ). У большинства бактерий и простейших в качест­ве главных изоферментов выступают Fe-СОД и Mn-СОД. Вместе с тем во многих гра- мотрицательных бактериях и микобактериях (А/, tuberculosis) показано наличие Cu,Zn- СОД, отличающейся широким разнообразием строения молекул. Также выделены и оха­рактеризованы достаточно экзотические изоформы СОД: в микроорганизмах Streptomyces и цианобактериях присутствует Ni-СОД, состоящая из 4 идентичных субъ­единиц по 13,4 кДа и содержащая 0,89 атомов Ni на субъединицу, а также Fe,Zn-COfl, состоящая из 4-х субъединиц по 22,2 кДа каждая, при этом на субъединицу приходится 0,40 атомов железа и 0,43 атомов цинка [841, 1680]; в бактериях разных видов (Nitrosomonas europaea, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Mycobacterium smegmatis, Streptococcus mutans, Propionibacterium shermanii и др.) выявлены димерные и тетрамерные формы Мп,Fe-СОД [1625].

По аминокислотной последовательности N- концевых участков Fe,Zn-COfl из Streptomyces coelicolor была схожа с Мп-СОД и Fe

СОД из других микроорганизмов [841]. Ферментативная активность Ni-СОД была близ­ка Cu,Zn-COfl из эритроцитов быка, по аминокислотной последовательности она прин­ципиально отличалась от Fe- и Mn-СОД из Е. coli, а также Cu,Zn-COfl из Saccharomyces cerevisiae, фермент был стабилен в области pH 4,0-8,0, однако при pH < 4 и > 9 его ак­тивность быстро снижалась; фермент выдерживал нагревание до 70 °С, ингибировался цианидом и Н2С>2, но слабо ингибировался азидом [1680]. Наличие микромолярных кон­центраций ионов Ni в культуральной среде увеличивало содержание Ni-СОД, но подав­ляло экспрессию Fe,Zn-COfl в клетках Streptomyces coelicolor [841].

~ Медь-цинковая форма (CuyZn-СОД; СОД1) чувствительна к цианиду и является главным цитозольным изоферментом, однако также выявляется в ядрах, пероксисомах, лизосомах и митохондриях клеток эукариот [860, 1592]. Анализ с помощью специфиче­ских антител локализации Cu,Zn-COfl в клетках печени и мозга крыс, а также фибробла­стах человека показал, что основная часть фермента содержится в цитоплазме, межмем- ^ бранном пространстве митохондрий и на поверхности пероксисом (рис. 44). Длительное время Cu,Zn-COfl рассматривалась как фермент, присущий только клеткам эукариот, хотя были известны прокариоты Photobacterium leiognathi, симбионт рыб семейства сребробрюшковых, и Caulobacter crescentus, на ранних стадиях эволюции также бывшая симбионтом, имеющие Cu,Zn-COfl и получившие изозим в результате естественного горизонтального переноса гена от хозяина [991, 1450]. В середине 90-х годов прошлого столетия в грамотрицательных бактериях был идентифицирован ген sodC, кодирующий Cu,Zn-COfl. В отличие от клеток эукариот, у которых основная часть фермента находит­ся в цитоплазме и внутриклеточных структурах, в бактериях Cu,Zn-COfl локализована в периплазме (пространство между внешней и внутренней мембранами) и на внешней стороне мембран (рис. 44); поэтому предполагается, что главное предназначение бакте­риальной Cu,Zn-COfl - не восстановление внутриклеточного О ~г, ибо эффективных ис­точников супероксид-аниона в бактериях не выявляется. Скорее, фермент служит для защиты от цитотоксического действия фагоцитирующих клеток, которое во многом оп­ределяется одноэлектронным восстановлением 02 активированной НАДФН-оксидазой, а также образованием пероксинитрита при взаимодействии Oj с N0* [475,1635].

Сегодня наличие Cu,Zn-COfl показано в разных штаммах грамотрицательных бакте­рий: Photobacterium leiognathi, Caulobacter crescentus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin, Haemophilus influenzae, Legionella, Actinobacillus и Pasteurella, E. coli, а также в грамположительных Mycobacterium tuberculosis. Анализ локализации Cu,Zn-COfl в микобактериях туберкулёза показывает, что основная часть фермента связана с мембранами клеток [1635]. В лабораторных условиях in vitro рост мутантных по гену sodC штаммов бактерий не отличался от развития бактерий, проду­цирующих Cu,Zn-COfl, однако мутанты были более чувствительны к действию экзоген­ного О 2 и активированных макрофагов. Гипотеза о защитном действии бактериальной Cu,Zn-COfl в отношении фагоцитов подтверждается низкой вирулентностью штаммов бактерий с выключенным геном sodC в экспериментах на животных. В некоторых внут­риклеточных инфекционных штаммах бактерий (Sulmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis) помимо sodC выявлены также гены sodCl, sodC2, sodC3, которые отвечали за синтез наиболее активных изоформ Cu,Zn-COfl [251]. Хотя аддитивного эффекта раз­ных изоферментов СОД в отношении цитотоксического действия стимулированных ин- терфероном-у перитонеальных макрофагов мыши не выявлялось, каждая форма СОД обладала защитным действием и повышала вирулентность бактерий [1340].

А



Молекулярная масса Cu,Zn-COfl 31 кДа, молекула состоит из двух идентичных субъ­единиц, каждая из которых содержит один атом Си2+, один атом Zn2+ и одну дисульфид- ную связь между Cys-57 и Cys-146; предполагается, что атом цинка необходим для ста­билизации молекулы, в то время как медь принимает непосредственное участие в дис- мутации. У человека ген, кодирующий Cu,Zn-COfl, локализован в 21 хромосоме (уча­сток 21q22) [913] (рис. 45), у крупного рогатого скота - в 1 хромосоме (1 ql2—>14) [1354], у мышей - в 16 хромосоме (16В4—>ter) [582]. Методом изоэлектрического фокусирова­ния выявляется множественность форм Cu,Zn-COfl, при этом у людей в зависимости от расовой принадлежности может преобладать та или иная форма [93]. Поверхность фер­мента несёт отрицательный заряд, однако в строении молекулы выявлены положительно заряженные каналы, которые ведут к активным центрам и служат, как предполагается, для захвата отрицательно заряженных молекул О ~2 [1670]. В результате такого избира­тельного захвата ионов О \ значительно повышается скорость реакции дисмутации.

В отличие от единой структуры Cu,Zn-COfl эукариот анализ аминокислотных после­довательностей Cu,Zn-COfl, выделенных из разных типов бактерий, выявляет значи­тельные вариации, что сопровождается изменением как строения молекул, так и их ак­тивности. Считается, что ферменты Cu,Zn-COfl эукариот и прокариот эволюционно происходят от одного первоисточника и имеют сходное строение активного центра, од­нако значительно различаются по архитектуре молекул. Возможно, что структурное раз­нообразие бактериальных Cu,Zn-COfl связано с выполнением дополнительных функций помимо дисмутации О \. Так, бактерии Haemophilus ducreyi (вызывают язвенные пора­жения гениталий) не способны синтезировать гем и вынуждены получать его из орга­низма хозяина; выделенная из данных бактерий Cu,Zn-COfl связывала гем и усиливала его транспорт внутрь бактерий [1174]. Одной из интересных особенностей Cu,Zn- супероксиддисмутаз, выделенных из штаммов бактерий Н. ducreyi и Н. parainfluenzae, является наличие богатых гистидином N-концевых участков, которые характерны для белков, связывающих ионы металлов переменной валентности [251]. В условиях недос­татка поступления ионов Си они вначале связываются с полигистидиновыми участками, а в последующем переходят в область активного центра фермента посредством внутри­молекулярного транспорта [252]. Наличие таких концевых доменов увеличивает антиок­сидантную активность Cu,Zn-COfl, в результате чего повышается устойчивость бакте­рий к цитотоксическому действию фагоцитов.

Благодаря хелаторам переменных металлов (см. ниже) содержание свободных ионов меди и цинка в клетках ничтожно мало, поэтому in vivo внедрение их во вновь синтези­рованные апобелки Cu,Zn-COfl путём пассивной диффузии невозможно. Так, в работе [1249], выполненной на клетках пекарских дрожжей, показано, что количество не свя­занных с биополимерами ионов Cu(II) не превышает 10 18 М, содержание же Cuh и того меньше - 10 23 М. Исходя из размеров клетки (10 14 л) и числа Авогадро, теоретически вычисленная концентрация свободной меди составляет 1 атом на 108 клеток, при этом на жизненный цикл каждой клетки приходится около 60 000 молекул Cu,Zn-COfl. Установ­лено также, что концентрация "свободных" ионов Zn(II) в клетках Е. coli составляет не более 5x10 16 М, то есть 1 атом на 106 клеток [566].

Каким же образом ионы Си и Zn доставляются в апобелки Си^п-СОД? Исследова­ниями последних лет установлено, что этот процесс осуществляют специальные вспомо­гательные белки, принадлежащие к семейству шаперонов - так называемые металлоша- пероны. Главная их функция заключается в прямом внедрении металла-кофактора в


фермент-мишень, в результате чего последний переходит из неактивного состояния в активное [1142].
П_В В 0 п
] 28сД

97 203

4396 117 3085 180 2210 Е

523

Мп-СОД

Рис. 45. Геномная организация изоформ супероксиддисмутазы человека; размер каждого экзона и интрона указан как количество пар оснований [1693]

На сегодняшний день наиболее хорошо изучены металлошапероны, осуществляю­щие включение ионов меди в Cu-содержащие ферменты; ведётся исследование вспомо­гательных белков для доставки в соответствующие ферменты других металлов - железа (активатор нитрилгидратазы Rhodococcus sp. N-771) [953], никеля (металлошаперон UreE служит для инкорпорации двух ионов Ni2+ в активный центр уреазы [1078], HybF внедряет ионы никеля в №,Ее-гидрогеназу Е. coli [285]), цинка (гипотетический метал­лошаперон онкопротеина Е6 вируса папилломы человека 16) [474].

Впервые металлошаперон, включающий ионы меди в апобелок супероксиддисмута­зы, обнаружен у дрожжей [720]; вскоре соответствующий белок был клонирован и у че­ловека - им оказался протеин, ранее считавшийся изоформой СОД [437]. Оба металло- шаперона получили название CCS (copper chaperone for SOD1). CCS представляет собой белок длиной 274 а. к. о. с молекулярной массой 29,0 кДа, содержащий три функцио­нально различающихся домена (рис. 46). N-концевой домен 1 и С-концевой домен III содержат высококонсервативные последовательности, представляющие собой медь- связывающие участки и гомологичные соответствующим участкам других металлоша- перонов меди [1142]; в активной молекуле CCS (связанной с медью) домены I и III рас­полагаются рядом друг с другом и при взаимодействии с апо-СОД1 внедряют атомы Cu(I) непосредственно в фермент (рис. 46) [1352]. За физическое взаимодействие с Cu,Zn-COfl отвечает центральный домен И; у человека он имеет настолько тесную го­мологию с ферментом, что единичная мутация (замена аспартата в положении 200 на гистидин) способна превращать CCS в СОД-подобную молекулу, способную катализи­ровать дисмутацию супероксид-аниона [1352].

На рис. 46 схематически изображено превращение апо-СОД1 в активный голофер­мент: неизвестным на сегодняшний день образом происходит внедрение в молекулу атомов цинка; в результате образования временного гетеродимера (или гетеромультиме­ра) между ано-СОД1 и CCS фермент получает атомы меди. Ещё одним важным этапом является окисление остатков цистеина в положении 57 и 3 46 с образованием вну гримо-
лекулярной дисульфидной связи, которое, как предполагается, может осуществляться либо в результате восстановления глутатиондисульфида (С88С) [1375], либо при уча­стии всё того же СС8 [316, 460]. Интересно, что полностью активированный фермент не проникает через митохондриальную мембрану, в то же время апо-Си,7п-СОД обладает такой способностью, и уже в межмембранном пространстве митохондрий он претерпе­вает посттрансляционную модификацию, аналогичную происходящей в цитоплазме клетки (внедрение атомов цинка и меди и образование внутрисубъединичной дисуль­фидной связи); таким образом, непосредственно участвуя в созревании фермента, СС8 способен прямо влиять на распределение Си,7п-С0Д между цитозольным и митохонд­риальным пулами [460].

ССБ

Ало СС8

Рис. 46. Внедрение атомов металлов в апобелок медь-цинковой изоформы СОД посредством СС8

[563, 1142]

В то же время, очевидно, существуют и другие способы внедрения атомов меди в ак­тивный центр медь-цинковой СОД: так, у трансгенных мышей с генотипом сс5-/~, неспо­собных синтезировать функционально активный белок ССБ, уровень полноценной СОД1 составлял 15 % по сравнению с животными дикого типа (то есть на 15 % актив­ность СОД1 обеспечивается СС8-независимым путём) [782].

Цианидрезистентная марганцевая форма (Мп-СОД; СОД2) локализована в мито­хондриях и матриксе хлоропластов эукариот, а также обнаруживается у бактерий [123, 1610]. Мп-СОД состоит из 4 (у бактерий - из 2) идентичных субъединиц, имеющих мо­лекулярную массу по 23 кДа каждая и содержащих 1/2 или 1 ион марганца в активном центре; по активности данная форма близка к Си,7п-СОД. Ген, кодирующий Мп-СОД человека, локализован^ 6 хромосоме, участок 6q25 [396] (у мышей - в 17 хромосоме), и не имеет сколько-нибудь значимой~гомологии с Си,7п-С0Д и Э-СОД (рис. 45). В то же время аминокислотная последовательность митохондриальной Мп-СОД близка к тако­вой для бактериальных ферментов, что подтверждает гипотезу о возникновении мито­хондрий в результате захвата бактерии-прокариоты эукариотической клеткой. Харак­терной особенностью Мп-СОД является её резистентность к действию Н202, а также индуцибельность: так, в фибробластах человека под действием ионизирующей радиации в 2 раза повышается скорость транскрипции мРНК Мп-СОД и в 3 раза - её стабильность [179]. Мп-СОД, как и Си,7л1-СОД, синтезируется в виде ферментативно неактивного апобелка и становится полноценным голоэнзимом только в результате посттрансляци­
онной модификации и внедрения атомов марганца, У дрожжей этот процесс осуществ­ляется в митохондриях с участием марганец-транспортирующего фактора (manganese trafficking factor, МТМ1), при экспериментальной инактивации которого активность СОД2 восстанавливается лишь при введении в среду культивирования больших концен­траций ионов Мп2+ [782].

В цитоплазме десятиногих ракообразных (крабы, омары, креветки) выявлен необыч­ный цитозольный изофермент СОД, который существует в форме гомодимера (находит­ся в равновесии "мономер-димер", 24 кДа

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Супероксиддисмутаза. Изоформы, структура, распространение:

  1. КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450
  2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ ЛЕКАРСТВ
  3. Организация и структура первичной медико-социальной помощи городскому населению. Структура городской поликлиники
  4. Распространение
  5. Распространение
  6. Распространенность
  7. Распространенность психической патологии. 1. Общие данные
  8. Распространенные методы исследований
  9. Эпидемиология или закономерности распространения опухолей
  10. Самые распространенные причины возникновения желчных камней
  11. Каковы наиболее распространённые факторы окружающей среды:
  12. 1.3. Факторы, влияющие на распространение новых технологий в сфере здравоохранения
  13. 1.3. Факторы, влияющие на распространение новых технологий в сфере здравоохранения
  14. Ультразвуковая диагностика наиболее распространенных врожденных пороков сердца