<<
>>

Восстановление кислорода цитохромом Р450

V * Помимо цитохромоксидазы митохондрий, восстанавливающей около 90 % потреб­ляемого 02, в клетках млекопитающих широко представлен другой класс ферментов - оксигеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции с участием моле­кулярного кислорода.

В настоящее время известно более 1000 индивидуальных фермен­тов этого класса и более 1200 кодирующих их генов. Оксигеназы разделяются на диок- сигена-зы, внедряющие два атома 02 в молекулу субстрата, и монооксигеназы, катали- / зирующие реакции с включением одного атома кислорода в субстрат, в то время как другой восстанавливается до воды. Наиболее многочисленными монооксигеназными реакциями являются реакции с участием цитохрома Р450 (КФ 1.14.14.1, неспецифиче­ские монооксигеназы). Впервые описанный в 1958 году микросомальный цитохром Р450 получил свое название за появление интенсивной полосы поглощения в области 450 нм у комплекса восстановленного цитохрома с СО. Монооксигеназы участвуют в синтезе и 'метаболизме многих важных классов физиологических соединений - стероидных гор­монов, желчных кислот, витаминов, нейротрансмиттеров, жирных кислот, простаглан- динов и др., однако основной физиологической функцией этих ферментов принято счи­тать детоксикацию ксенобиотиков посредством гидроксилирования в реакции:

ХН + 02 + АН2 > ХОН + Н20 + А,

Г где X - ксенобиотик, АН2 - донор электронов.

' У человека суперсемейство цитохрома Р450 (CYP) представлено 57 функционально активными генами и 58 псевдогенами. Из них основной вклад в метаболизм ксенобиоти­ков вносят цитохромы первых четырех семейств (CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4). Обычно в качестве восстановителя в монооксигеназных реакциях участвует НАДН или НАДФН. Механизм, благодаря которому цитохром получает электрон от НАДФН, зависит от внутриклеточной локализации цитохрома Р450. В эндоплазматическом ретикулуме эу­кариот, где расположено большинство гемопротеидов, электрон передается через фла- вопротеин, называемый НАДФН-Р450-редуктаза, и цитохром Ь5. Одна молекула редук­тазы может доставлять электроны на несколько различных молекул Р450. В митохонд­риях, где расположены цитохромы Р450, участвующие в биосинтезе стероидных гормонов и метаболизме витамина D, электрон переносится с помощью двух белков: ферродоксина или ферродоксинредуктазы.

Цитохром Р450 уникален по структуре, так как атом железа входящего в его состав гема связан с атомом серы цистеинового остатка, что придаёт ферменту высокую вос­станавливающую способность. Молекулярная масса различных Р450, выделенных из многих организмов, начиная от бактерий и заканчивая человеком, находилась в преде­лах от 44 до 60 кДа, этот гемопротеин отсутствует только у строго анаэробных бактерий. Предполагается, что появление системы цитохрома Р450 около 2,5 млрд, лет назад было вызвано повышением содержания молекулярного кислорода в атмосфере и ростом био­
логического многообразия, приведшего к острой конкурентной борьбе с помощью фи тоалексинов, микотоксинов и других органических соединений [625].

Древние прока риоты избавлялись от токсического кислорода, встраивая его в наиболее доступный суб­страт окисления и выводя полученный продукт наружу; более поздние эукариоты, сор­бировав гены разных монооксигеназ, получили универсальную систему детоксикации ксенобиотиков, а соответственно - и защиты от бактериальных токсинов. Прокариоты содержат растворимый Р450, переход к эукариотическим системам сопровождается встраиванием цитохрома в мембрану, при этом у высших организмов все ферменты се­мейства цитохрома Р450 - мембранные ферменты.

Функционально и «топографически» энзимы-члены семейства цитохрома Р450 мож­но разделить на две категории: изоферменты, необходимые для синтеза стероидных гормонов, расположены в надпочечниках, яичниках, семенниках, молочной железе, а изоформы, назначение которых сводится к выведению чужеродных липофильных ве­ществ из организма, экспрессированы в органах, наиболее подверженных воздействию чужеродных веществ, таких как печень, почки, лёгкие, кожа, слизистые оболочки носа и кишечника. В отличие от большинства функционально детерминированных ферментов, цитохром Р450 катализирует протекание разнообразных окислительных реакций с ши­роким кругом субстратов. Столь нехарактерное для энзиматических реакций отсутствие специфичности объясняется существованием большого количества изоформ с различ­ным механизмом регуляции экспрессии и являющихся продуктом различных генов. Так, наряду с моношссигеназной^активностью, P45Q может проявлять и оксидазную актив­ность, генерируя О 2, Н202 и ОН*. В связи с этим в литературе иногда Р450 называют оксидазой со смешанной функцией, более того, он может функционировать и как истин­ная четырёхэлектронная оксидаза, генерируя только воду из молекулы 02. Р450 обнару­живает и пероксидазную активность, используя в реакции окисления в качестве ко- субстратов, вместо НАД(Ф)Н, органические перекиси или перекись водорода. Имеются данные, что Р450 может катализировать диоксигеназные реакции.

В ранних работах обосновывалось утверждение, что при микросомальном окислении не образуются активные формы неполного восстановления кислорода [52], хотя образо­вание радикалов возможно в процессе метаболизма некоторых ксенобиотиков [14]. Это ошибочное утверждение основывалось на экспериментальных данных по биохемилю минесценции, которые показывали, что спонтанное свечение, отражающее продукцию АКМ, микросом в большинстве случаев снижалось при добавлении субстрата окисле ния. По-видимому, в этих работах снижение биохемилюминесценции было вызвано ис­пользованием в качестве субстратов полициклических соединений, обладающих опреде­лённым антиоксидантным действием. Исследования последних лет показали, что до 75 % поглощаемого в микросомах кислорода может переходит в АКМ [6, 11, 12, 21]: так, измеренные in vitro скорости поглощения 02 и образования О 2 микросомами интактной печени крысы составляли соответственно 2,67 ± 0,14 и 2,0 ± 0,14 нмоль/мин/мг белка [11]. Однако, это не значит, что О 2 является доминирующей формой АКМ, образую­щейся в микросомах, часто применяемые методы не позволяют точно дифференциро­вать разные продукты восстановления молекулярного кислорода.

Предполагается, что микросомальный О 2 возникает в системе цитохрома Р450 на участке «НАДФН - цитохром Р450-редуктаза - цитохром Ь5»у а также при распаде реак­ционного комплекса «окисленный цитохром Р450 - субстрат - О 2 » (рис. 22) [6, 11, 334, 1056]. После индукции фенобарбиталом продукция АКМ микросомами крыс ингибиро-
г

валась антителами к подсемейству CYP2B1/B2 цитохрома Р450 и значительно меньше снижалась в присутствии антител к цитохрому Ъ5 [801]. Это указывает на то, что глав­ными продуцентами OJ и Н2О2 в микросомах являются пероксо- и гидропероксо- железные комплексы цитохрома Р450, возникающие в процессе каталитического цикла [265, 1099]. Предполагается, что при распаде пероксо-комплексов (Fe3+-0 2 ) преимуще­ственно образуются супероксидный анион (О 2 ) и синглетный кислород (!02), в то время как при распаде гидропероксо-комплексов (Fe -Н02) возникают более восстановленные формы АКМ: Н202 и ОН* [1093]. Аналогично цитохромоксидазе митохондрий эффек­тивными ингибиторами активности цитохрома Р450 (CYP2E1) и генерации О 2 и Н202 в микросомах печени крыс являются NO-радикалы, которые конкурируют с 02 за связы- / вание с гемовой частью цитохрома [395, 802]. После отщепления молекулы воды в цик­ле окислительных преобразований гема цитохрома Р450 возможно образование реакци­онного радикального комплекса (Fe4+=0)*, который также может служить источником с АКМ [1093]. Однако существование таких промежуточных структур (Fe4+=0)* в реакци­ях с гемовыми ферментами достаточно сложно регистрировать, поэтому вопрос их су­ществования остается открытым.

НАДФН

О

oï4


НАДФН-цитохром Р450-редуктаза

НАДН-цитохром Р450-редуктаза

НАДН

Рис. 22. Гидроксилирование субстрата (RH) и образование О 2, Н202 и ОН* в НАДФН- цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системе

Продукция АКМ цитохромом Р450 зависит от многих факторов: прежде всего изо­формы самого цитохрома Р450, микроокружения, pH среды, концентрации 02, наличия

восстановителей и субстратов окисления [183, 229, 803]. In vitro максимальная продук­ция АКМ (Н2О2 и ОН*) микросомами печени крыс наблюдалась при 20-процентной кон­центрации кислорода в газовой фазе над средой инкубации, более высокие концентра­ции 02 снижали активность НАДФН-цитохром-Р450-редуктазы и восстановление ионов железа в составе гема [804]. Анализ образования АКМ разными изоформами Р450 в микросомах печени человека выявил следующую зависимость окисления НАДФН и об­разования О 2 : CYP3A4 > CYP1A1 > CYP1A2 ~ CYP2B6 [803]. Микросомы печени че-^ ловека по сравнению с микросомами печени крыс генерировали в 3-5 раз меньше О 2 и Н202 в пересчёте на мг белка, однако в пересчёте на содержание цитохрома Р450 про­дукция АКМ была сходной [819]. Увеличение синтеза АКМ в пересчёте на мг белка на­блюдалось в микросомах крыс после индукции синтеза Р450 введением ксенобиотиков (фенобарбитала, 3-метилхолантрена или 4-метил пиразола), при этом в пересчёте на нмоль цитохрома Р450 продукция АКМ не изменялась [801]. Наработка АКМ выделен­ными из печени микросомами ингибируется СОД, в меньшей степени каталазой, не за­висит или мало зависит от наличия субстрата окисления, и в большей степени усилива­ется при добавлении в среду НАДФН по сравнению с НАДН [183, 801].

Факт генерации АКМ в каталитическом цикле Р450-зависимой монооксигеназной ре­акции порождает вопрос о том, имеет ли он какую-то целесообразность или является просто неизбежным побочным следствием. В литературе по этому поводу обсуждаются точки зрения, согласно которым: 1) продукция высокореакционных форм АКМ 102 и ОН* в монооксигеназных реакциях позволяет клеткам метаболизировать все органиче­ские соединения, ибо данные продукты активации кислорода способны разорвать лю­бую С-С- или С-Н-связь; и 2) образование АКМ задает некоторый уровень неспеци- фичности действия монооксигеназ, благодаря чему любая изоформа фермента может метаболизировать широкий спектр ксенобиотиков. Продукция АКМ монооксигеназами может быть важна для регуляции тонуса сосудов [354], а также синтеза медиаторов и регуляторов биологических процессов при развитии свободнорадикальных патологий, таких как воспаление [964] или ишемия/реперфузия [414]. Так как реакции микросо- ] мального окисления наиболее активно протекают в печени, то предполагается, что для данного органа микросомы служат главным источником АКМ, и в частности О ~г [183].

Генерация АКМ цитохромом Р450 2Е служит причиной свободнорадикального повреж­дения гепатоцитов и развития цирроза печени при хроническом цотреблении алкоголя [229]. Посредством синтеза АКМ и индукции свободнорадикальных окислительных процессов разные изоформы Р450 могут участвовать в гепатотоксическом действии ле­карственных препаратов: парацетамола, диклофенака, галотана, дигидралазина, карба- мазепина, феноксиуксусной и вальпроевой кислот, такрина, кокаина и др. [1024]. В большинстве работ изучаются микросомальные монооксигеназы, однако увеличение содержания митохондриальной изоФормы (CYP2E1) цитохрома Р450 при эксперимен­тальном диабете у крыс может вносить определённый вклад в синтез АКМ и индукцию ПОЛ в митохондриях [824]. , ^

Кроме того, образование АКМ микросомальными монооксигеназами может быть в определенных условиях важным для функции самой ферментативной системы метабо­лизма ксенобиотиков: обратной негативной регуляции цитохрома Р450, индукции фер­ментов 2 фазы метаболизма ксенобиотиков, повышения антиоксидантной защиты кле­ток. Продукция АКМ микросомальными монооксигеназами вызывает окислительную модификацию и деградацию белков, в том числе самого цитохрома Р450 [244, 402]. Ци­
тохром Р450 2Е1 характеризуется наиболее коротким временем существования в клет­ках по сравнению с другими изоформами Р450 (CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1, CYP2B2 и CYP3A). В отсутствие субстрата окисления деградация CYP2E1 в микросомах печени крыс происходит по двухфазному механизму и характеризуется двукратным снижением содержания цитохрома за 6-7 часов, наличие этанола увеличивало время 50-процентной деструкции цитохрома до 37 часов [844]. CYP2E1 является высокочувствительным к разрушающему действию АКМ - в аналогичных условиях структура альбумина не из­менялась [244]. Наличие НАДФН (1 мМ) в среде повышает скорость деградации CYP2E1 в микросомальной фракции из печени человека; антиоксиданты тролокс (50 мкМ) и а-токоферол (20 мкМ), а также хелаторы ионов железа дефероксамин (40 мкМ) и ЭДТА (100 мкМ) ингибируют разрушение CYP2E1 [402]. АКМ могут прямо снижать экспрессию цитохром Р450-зависимых ферментов посредством прямого ингибирования транскрипционной активности рецепторов Ahr и ядерного фактора NF1 (nuclear factor j_) или через активацию другого фактора транскрипции - NF-kB [265, 396].

<< | >>
Источник: Меныцикова Е. Б. и др.. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово»,2006. - 556 с.. 2006
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Восстановление кислорода цитохромом Р450:

  1. КЛАССИФИКАЦИЯ ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450
  2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОФОРМ ЦИТОХРОМА Р450, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ ЛЕКАРСТВ
  3. ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ
  4. МЕТОД СЖИГАНИЯ В КОЛБЕ С КИСЛОРОДОМ
  5. Определение максимального потребления кислорода (МПК)
  6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АЗОСОЕДИНЕНИЙ
  7. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ ЭПОКСИДОВ
  8. ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЕТОНОВ
  9. ВОССТАНОВЛЕНИЕ НИТРОСОЕДИНЕНИЙ
  10. ВОССТАНОВЛЕНИЕ
  11. Педагогические средства восстановления
  12. Восстановление синусового ритма
  13. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПИРИМИДИНОВ