<<
>>

Исследование механизма действия хромогликата in vitro. Подавление выделения гистамина тучными клетками

Перитонеальные тучные клетки крыс активно используются для изучения механизма действия хромогликата по следующим причинам: во- первых, выделение гистамина тучными клетками рассматривается как основная часть патогенеза астмы; во-вторых, перитонеальные тучные клетки крыс могут служить типичным примером изолированных тучных клеток, относительно легко получаемых в очищенном виде. Однако обнаружение гетерогенности тучных клеток (см. главу 2) предполагает, что перитонеальные тучные клетки крыс не всегда являются идеальной моделью тучных клеток легких человека.

Кроме того, накапливается все больше данных о том, что роль тучных клеток в патогенезе астмы не столь значительна, как это представлялось раньше. Тем не менее показано, что хромогликат подавляет выделение медиаторов из тучных клеток человека как in vitro, так и in vivo, а исследования на перитонеальных тучных клетках крыс и крысиных клетках базофильного лейкоза в настоящее время позволяют получать наиболее полную информацию о механизме действия хромогликата на клеточном уровне.

Хромогликат (1-100 мкМ) вызывает дозозависимое подавление выделения гистамина перитонеальными тучными клетками, стимулированными реакцией антиген-антитело или соединением 48/80. Степень подавления выделения гистамина под действием соединения 48/80, которая достигается при использовании хромогликата, при низком уровне стимуляции явно выше, чем при высоком. Хромогликат эффективен при его добавлении к тучным клеткам одновременно с антигеном; предварительная преинкубация клеток с препаратом снижает эффект. По данным некоторых исследований, определенные концентрации хромогликата подавляют выделение гистамина тучными клетками, стимулированными антигеном, но не влияют на высвобождение медиатора под действием кальциевого ионофора А23І87 (см. главу 2). Эти данные свидетельствуют о том, что хромогликат подавляет выделение гистамина, нарушая антигениндуцированный вход кальция в тучные клетки, что и было показано для хромогликата, доксантразола (родственный препарат) и дибутирила цАМФ. Активность указанных соединений как ингибиторов транспорта кальция была такой же, как и ингибиторов выделения гистамина.

Данная гипотеза представляется слишком простой: ведь если выделение гистамина тучными клетками индуцируется ионофором А23187, то ЕС50 хромогликата для его подавления составляет 300 мкМ, а при использовании в качестве стимула антигена и соединения 48/80- 10 мкМ. Кроме того, против механизма действия хромогликата, направленного на предупреждение изменений потоков кальция, приводятся данные о блокировании хромоглика- том выделения гистамина под действием стимулов, не зависящих от внеклеточного кальция. Однако это не является обязательным условием. Установлено, что выделение гистамина тучными клетками зависит от возрастания внутриклеточной концентрации ионизированного кальция (см. главу 2). Кальций имеет либо внеклеточное происхождение, либо высвобождается из внутриклеточного депо. Не исключено, что транспорт кальция через клеточную мембрану или через мембраны внутренних депо одинаков, поэтому хромогликат может нарушать оба процесса одним и тем же механизмом, например фосфорилированием особых белков (см. ниже). Без всякого сомнения, хромогликат подавляет выделение гистамина тучными клетками, которое индуцируется ионофором, но этот факт сам по себе не отрицает возможного наличия разных механизмов влияния хромогликата на транспорт кальция в тучных клетках и на некоторые другие биохимические события, относящиеся к потоку кальция и происходящие более дистально в секреторном механизме.

Тахифилаксия

При изучении хромогликата как ингибитора выделения гистамина тучными клетками отмечено, что препарат более эффективен при его использовании одновременно со стимулятором процесса. Данный факт не совсем обычен,

поскольку многим препаратам для проявления их максимального ингибиторного эффекта требуется предварительная инкубация с тканью. Для хромогликата установлена обратная зависимость: сила подавления выделения гистамина уменьшаетсяс увеличением времени преинкубации с препаратом перед добавлением стимулятора. Это также контрастирует с клиническими наблюдениями при использовании хромогликата, который активен при введении за 2 и 18 ч до провокации бронхиальной астмы антигеном. На крысиных тучных клетках подавление хромогликатом выделения гистамина уменьшается в пределах преинкубационного времени 0-10 мин. При внесении хромогликата за 20 мин до стимуляции регистрируется лишь 75% эффекта, получаемого при внесении препарата одновременно со стимулом. При преинкубации клеток с препаратом более 20 мин ингибиторный эффект хромогликата вновь возрастает. Таким образом, минимальный ингибиторный эффект наблюдается в промежутке преинкубационного времени 10-20 мин. Интересно, что точно такой же феномен наблюдается при использовании хромогликата для подавления выделения гистамина из фрагментов легких крыс или при ингибировании пассивной кожной анафилаксии в коже крыс. Уменьшение ингибиторного действия хромогликата при увеличении времени преинкубации с тканями перед стимуляцией не связано с захватом, метаболизмом или другой инактивацией препарата, поскольку дополнительное внесение препарата в момент стимуляции тканей не вызывает усиления ингибиторного эффекта или отмены тахифилаксии, вызванной преинкубацией. Тахифилаксия, индуцированная хромогликатом, зависит и от концентрации препарата: более высокие концентрации вызывают и более сильную тахифилаксию.

После открытия хромогликата было разработано множество препаратов, подавляющих выделение гистамина тучными клетками in vitro и пассивную кожную анафилаксию. Примером подобных соединений могут служить доксантразол и буфролин. Показано, что некоторые из этих соединений обладают перекрестной тахифилаксией с хромогликатом, что указывает на общие механизмы их действия, а именно подавление выделения гистамина тучными клетками. Интересно, что флавоноид кверцетин, являющийся ингибитором выделения гистамина, также обнаруживает перекрестную тахифилаксию с хромогликатом. К сожалению, эти препараты не обладают аналогичной хромогликату клинической антиастматической активностью. Это свидетельствует о том, что действие хромогликата и данных веществ на тучные клетки крыс имеет мало общего с клинической эффективностью препарата.

Механизм тахифилаксии хромогликата неясен; известно, однако, что она не обусловлена инактивацией препарата. Предполагается, что хромогликат подавляет выделение гистамина, вызывая образование компонента, опосредующего ингибирование. В этом случае тахифилаксия должна отражать истощение этого эндогенного компонента, несмотря на присутствие препарата на его рецепторе. Одним из кандидатов на роль эндогенного компонента, образование которого вызывается хромогликатом, является фосфорилированный белок (см. ниже); в таком случае тахифилаксия отражает автоматическую дефосфориляцию белка в клетке в присутствии хромогликата.

Влияние на транспорт кальция: хромогликатсвязывающий белок

В настоящее время получены убедительные доказательства индукции выделения гистамина клетками под действием возрастающих концентраций ионизированного кальция в цитозоле после взаимодействия антигена с мембранным IgE (см.

главу 2). Увеличение концентрации обеспечивается, по крайней мере частично, перемещением внеклеточного кальция во внутриклеточный отсек. Как полагают, кальций перемещается по мембранным каналам, которые открываются при взаимодействии антигена и IgE на поверхности мембраны. Одна из ранних гипотез о механизме действия хромогликата заключается в том, что препарат предупреждает вход кальция в тучные клетки,

стимулированные взаимодействием антиген- IgE. В качестве доказательства приводятся данные исследований, в которых хромогликат предупреждает захват 45 Са тучными клетками, стимулированными взаимодействием антиген- IgE; причем активность препарата в отношении захвата 45Са сравнима с активностью препарата как ингибитора секреции гистамина этими клетками.

В последующем было показано, что хромогликат в органических растворителях образует комплексы с двухвалентными катионами, включая Mg, Ca, Sn, Ba, Zn и Мп. Эти комплексы образуются за счет электростатического взаимодействия двух карбоксильных групп хромогликата с двумя положительными заря-

дами двухвалентных ионов со стохиометрией 1:1. Однако захват кальция хромогликатом не объясняет его активности как ингибитора выделения гистамина по двум причинам: а) хро- могликат подавляет выделение гистамина в микромолярной концентрации в присутствии миллимолярной концентрации внеклеточного кальция; б) у тучных клеток, обработанных хромогликатом, а затем отмытых от него, сохраняется подавление выделения гистамина. Показано, что хромогликат подавляет выделение гистамина посредством механизма, включающего взаимодействие препарата и ионов кальция с мембранным белком. Для изучения связывания хромогликата с базофильными лейкозными клетками крыс (RBL-2H3) препарат добавляли в нерастворимые матриксы бус. Связывание препарата специфично в отношении клеток RBL-2H3 и не определяется у клеток мастоцитомы Р-815, не секретирующей гистамин, а также у тимоцитов. Удаление трипсином мембранного белка отменяет связывание хромогликата с клетками RBL, как и связывание кальция с помощью EDTA. Следовательно, хромогликат взаимодействует с мембранным белком на клетках RBL, для чего требуются ионы кальция. Связывание клеток и хромогликата, конъюгированного с бусами, предупреждается свободным хромогликатом, тогда как хромогликат, конъюгированный с бусами, подавляет выделение гистамина из клеток в ответ на стимуляцию антиген-IgE.

Данные наблюдения свидетельствуют о наличии мембранного белкового рецептора для хромогликата. Были предприняты попытки изолировать рецептор с помощью двух самостоятельных подходов, один из которых включает в себя аффинную хроматографию, а другой-иммунопреципитацию мембранного белка. В результате исследований получен белок с молекулярной массой 60 000, который специфичен для клеток RBL-2H3 и не выявляется на клетках мастоцитомы Р-815 и тимоцитах. Свободный хромогликат и EDTA предупреждают иммунопреципитацию белка антителами к хромогликату. В ряде очень изящных экспериментов продемонстрирована функциональная значимость полученного белка. Некоторые варианты клеток линии RBL-2H3 несут IgE-pe- цепторы, но не выделяют гистамин в ответ на стимуляцию антиген-IgE. Эти варианты клеток секретируют гистамин при действии ионо-фора А23187, что указывает на сохранность секреторного механизма, который активируется повышением концентрации внутриклеточного свободного кальция. Данные варианты клеток неспособны захватывать 45Са при стимуляции реакцией антиген- IgE на мембране, где не выявляется белок, связывающий хромогликат. Поэтому был сделан вывод о том, что хромогликатный рецептор мембраны представляет собой транспортный белок кальция, который необходим для выделения гистамина при стимуляции антиген- IgE. Соответственно хромогликат подавляет выделение гистамина, нарушая транспортную функцию этого белка в отношении кальция.

Дополнительные подтверждения гипотезы о роли белка, связывающего хромогликат, получены при слиянии очищенного хромогликат- связывающего белка, заключенного в оболочку вируса Сендай, с вариантом клеток RBL-2ffi, неспособных секретировать гистамин в ответ на стимуляцию реакцией антиген-IgE. Такое слияние с включением белка в дефектные клетки превращает их из нереактивных в отвечающие на стимуляцию антиген- IgE. Кроме секреции гистамина в ответ на антигенную стимуляцию, вариантные клетки становятся способными к захвату 45Са. Захват кальция и секреция гистамина в ответ на стимуляцию антиген- IgE пропорциональны количеству хромогликатсвязывающего белка, внесенного в клетку, причем насыщение ответа достигается на уровне, соответствующем содержанию белка в нормальных отвечающих клетках RBL.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что белок, связывающий хромогликат, является белком, переносящим кальций, который необходим для секреции гистамина клетками RBL, стимулированными взаимодействием антиген- IgE. Экспериментально выполнен следующий этап исследования: включение белка, связывающего хромогликат, в липидный бислой индуцирует проводимость бислоя при его обработке антителами к белку. Антиген или анти-IgE подобным действием не обладает. Проводимость бислоя возникает при наличии Fc-рецептора и(или) одного связывающего белка, но в отсутствие антигена. Проводимость каналов, образуемых в двойном слое в результате перекрестного связывания Fc-pe- цепторов для IgE в присутствии хромогликатсвязывающего белка, составляет примерно 2pS, но «время открытия» слишком вариабельно для точного определения.

Эти очень изящные эксперименты направлены на определение наличия в мембранах клеток RBL белка, способного к формированию каналов. Более специфично белок взаимо-

действует с Fc-рецепторами для IgE, поскольку перекрестное связывание Fc-рецепторов антигеном активирует функцию кальциевых каналов. Однако при обсуждении данной модели необходимо сделать одну или две оговорки. Недавно при использовании метода быстрой фиксации не удалось выявить каких-либо каналов в мембранах интактных тучных клеток, стимулированных взаимодействием антиген- IgE. Возможно, каналы не обнаруживаются именно этим методом; не исключаются, однако, и иные объяснения, полученные на основании данных других экспериментальных работ (см. главу 2). Клетки RBL являются, кроме того, чистой линией, в которой идентифицирован белок, связывающий хромогликат, поэтому необходимо проведение подобных исследований на других клеточных линиях, таких как крысиные перитонеальные тучные клетки или (лучше) тучные клетки человека. По сравнению с тучными клетками крыс клетки RBL относительно нечувствительны к подавлению хромо- гликатом выделения гистамина, которое вызвано антиген- IgE; поэтому ряду исследователей не удалось получить подавление выделения гистамина хромогликатом на клетках RBL.

Фосфорилирование белков

Известно, что фосфорилирование белков играет основную роль в регуляции клеточных функций (см. главы 2, 3, 4). При стимуляции тучных клеток из перитонеальной полости крыс происходит фосфорилирование белков с молекулярной массой 68 000, 59000 и 42000; эти фосфо- рилированные белки участвуют в активации процесса секреции гистамина (см. главу 2). Белок тучных клеток с молекулярной массой 78 000 также подвергается фосфорилированию, но, вероятно, этот процесс связан с down-регуляцией секреции гистамина (см. главу 2).

Хромогликат вызывает фосфорилирование белка с молекулярной массой 78 000 при отсутствии любой стимуляции клеток. Кривая концентрация - эффект для хромогликатинду- цированного фосфорилирования совершенно идентична кривой для вызванного хромогликатом подавления выделения гистамина при стимуляции соединением 48/80. Если фосфорилирование данного белка связано с обратной регуляцией, то его фосфорилирование хромогликатом объясняет подавление секреции гистамина этим препаратом. Более того, индуцированное хромогликатом фосфорилирование белка специфично в отношении белка с молекулярной массой 78000, а препарат одинаково эффективен как ингибитор секреции и как индуктор фосфорилирования при его введении одновременно со стимулятором тучных клеток (соединение 48/80). При обеих формах активности хромогликата (фосфорилирование и подавление секреции) выявлена тахифилаксия. Повторная экспозиция клеток с хромогликатом не вызывает фосфорилирования. Временные характеристики дефосфорилирования белка с молекулярной массой 78000 идентичны временным характеристикам потери чувствительности (тахифилаксия) тучных клеток к хро- могликату при тестировании подавления выделения гистамина.

Фосфорилирование белка тучных клеток с молекулярной массой 78000 стимулируется и другими хромонами, отличающимися от хромогликата. Относительная активность хромонов как ингибиторов гистаминовой секреции соответствует их активности как индукторов фосфорилирования с молекулярной массой 78 000. Напротив, другие ингибиторы секреции гистамина, сальбутамол и дибутирил цАМФ, вызывающие фосфорилирование белка через цАМФ-зависимые протеинкиназы, не инициируют фосфорилирования белка тучных клеток с молекулярной массой 78 000. Таким образом, если индукция фосфорилирования является механизмом, с помощью которого хромогликат подавляет секрецию гистамина, то данный процесс не опосредуется цАМФ-зависимыми протеинкиназами. Показано, что дибутирил-и 8- бромоциклический ГМФ фосфорилируют белок с молекулярной массой 78 000 так же, как хромогликат, поэтому не исключено, что хромогликат может активировать цГМФ-зависи- мую протеинкиназу. В нескольких работах показано, что хромогликат и другие новые соединения с аналогичным механизмом действия являются ингибиторами фосфодиэстераз циклических нуклеотидов, но во всех случаях значения ІС50 для хромогликата при подавлении фосфодиэстеразы были по крайней мере на 1 - 2 порядка выше ІС50 при подавлении секреции гистамина. Одна из фосфодиэстераз тучных клеток обладает преимущественным сродством к цГМФ как к субстрату, а поскольку этот циклический нуклеотид фосфорилирует тот же белок, что и хромогликат, не исключено, что хромогликат может действовать (по крайней мере частично), предотвращая распад цГМФ.

В более поздних работах отмечалось, что протеинкиназа С фосфорилирует ряд белков

тучных клеток и клеток RBL (см. главу 2) и может быть мишенью для хромогликата. Белки, фосфорилированные киназой С, могут

участвовать в активации и прекращении выделения гистамина; однако прямых доказательств изменения активности киназы С под действием хромогликата пока нет.

<< | >>
Источник: Коллектив авторов. Руководство по иммунофармакологии: Пер. с англ./Под ред. Р84 М.М. Дейла, Дж. К. Формена.-М.: Медицина,1998. 1998

Еще по теме Исследование механизма действия хромогликата in vitro. Подавление выделения гистамина тучными клетками:

  1. Исследование механизма действия хромогликата на экспериментальных моделях in vivo
  2. 51.3. Исследование других выделений организма человека (мекония, сыровидной смазки, около­плодной жидкости, молока, молозива, кала, выделений из влагалища)
  3. Исследования in vitro
  4. МЕХАНИЗМ ОСВОБОЖДЕНИЯ ГИСТАМИНА
  5. РОЛЬ ГИСТАМИНА В МЕХАНИЗМЕ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
  6. 51.2. Исследование слюны, мочи, пота и потожировых выделений
  7. Глава 51. Судебно-медицинское исследование других выделений. 51.1. Общие положения
  8. 51.5. Основные вопросы, решаемые судебно-медицинской экспертизой при исследовании других выделений
  9. Механизм действия
  10. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
  11. Механизм действия
  12. Механизмы действия ГК
  13. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ антибиотиков
  14. Механизм действия адъювантов
  15. Механизм действия антибиотиков
  16. Механизм действия
  17. Глава З МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ
  18. Механизмы действия ноотропов
  19. Механизмы действия иАПФ и АК