<<
>>

Изучение метаболизма клеток иммунной системы

Метаболизм клеток иммунной системы может быть исследован широким спектром аналитических методов. Однако спектрофотометрический метод как наиболее широко используемый в лабораторной диагностике не всегда может быть применим из-за большого объема исследуемого материала.

В связи с этим, остановимся на описании двух видов анализа - оптимальных к применению для определения активности ферментов в клетках иммунной системы - это биолюминесцентный и цитоморфоденситометрический анализ.

Под люминесценцией понимается широкий ряд реакций, в которых возбужденные молекулы переходят в основное состояние с испусканием кванта света. При биолюминесценции образование электронно - возбужденного состояния одной из молекул, участвующей в процессе, происходит с помощью ферментативной реакции [Светящиеся бактерии, 1984].

Глубокое изучение биологии светящихся бактерий и химизма их свечения, проведенное в Институте биофизики СО РАН (г. Красноярск), позволило разработать методы бактериального культивирования, а также выделения и очистки ферментов биолюминесцентной системы [Светящиеся бактерии, 1984]. Сопряженная биолюминесцентная система светящихся бактерий осуществляет следующую цепь ферментативных реакций:

ФМН + НАД(Ф)Н + H+ ФМН:НАД(Ф)Ноксидореду ктаза ФМН-Н2 + НАД(Ф);

2)

ФМН-Н2 + RСНО + О2 люцифераза ФМН + Н2О + RСООН + Свет

RСНО — алифатический альдегид;

RСООН — жирная кислота.

Таким образом, все ферментативные реакции, в процессе которых происходит наработка или утилизация субстратов или кофакторов данной биферментной системы, могут быть исследованы с помощью биолюминесцентных методов. В перечень определяемых биолюминесцентным методом ферментов, субстратов и кофакторов можно также включить показатели, которые могут быть исследованы с помощью сопряженных реакций.

Перспективность применения биолюминесцентных методов исследования определяется несколькими факторами: 1 - конечным продуктом люциферазной реакции является свет, который легко и с большой точностью измеряется при помощи современной электронно-оптической техники. Пределы обнаружения АТФ и НАДН составляют соответственно 10-10 и 10-16 моль/л [Светящиеся бактерии, 1984; Тюлькова Н.А., Антонова Э.В., 1991]. Биолюминесцентный метода анализа НАДН обладает в 25000 раз более высокой чувствительностью по сравнению со спректрофотометрией; 2 - в основе светоизлучения лежат ферментативные реакции, что определяет высокую специфичность метода; 3 - экспрессность и высокая чувствительность метода позволяет проводить исследования в микрообразцах биологического материала с минимальным количеством реактивов. Это не только снижает стоимость исследования, но и позволяет использовать биолюминесцентный метод в клинической практике.

Таким образом, перечисленные преимущества биолюминесцентных методов определяют ценность их применения в медико-биологических исследованиях для выявления и тестирования различных метаболических параметров, имеющих диагностическую и прогностическую значимость.

Нами разработаны биолюминесцентные методы определения активности следующих НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ: глюкозо-6- фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), глицерол-3- фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ, КФ 1.1.1.8), малик-фермент (НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40), НАД- и НАДН-зависимые реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ, КФ 1.1.1.27), НАД- и НАДН-зависимые реакции ма- латдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ- и НАДФН- зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФ-ГДГ и НАДФН-ГДГ, КФ 1.4.1.4), НАД- и НАДН-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАД-ГДГ и НАДН-ГДГ, КФ 1.4.1.2), НАД- и НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогена-

за (НАД-ИЦДГ, КФ 1.1.1.41 и НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42 соответственно) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2). Биолюминесцентное определене активности прямых (НАД- и НАДФ-зависимых) реакций указанных дегидрогеназ проводили следующим образом: 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов (лимфоциты разрушали путем осмотического лизиса с добав-

-5

лением дитиотреитола (ДТТ) 1,5*10- М) вносили в 600 в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат в концентрации 10-5-10-2 М и кофермент в концентрации 10-6-10-2 М при рН 70-10,0 (в 0,1 М К+,№+-фосфатном или трис-НС1-буфере). После инкубации при 370 С в течение 30 мин к 200 мкл инкубационной смеси добавляли биолюминесцентные реактивы: 50 мкл миристинового альдегида в концентрации 0,0005 %, 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) - 1,5*10-5 М и 50 мкл биферментного комплекса - НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза. Все реактивы биолюминесцентной системы разведены в 0,1 М К+,№+- фосфатном буфере с рН 7,0. После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминесцентного анализатора БЛМ-3607 (сконструирован в СКТБ “Наука”, г. Красноярск) производили измерение свечения.

Ферментативная система НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза- люцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики СО РАН г. Красноярска [Тюлькова Н.А., Антонова Э.В., 1991].

Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, нами определялись показатели, условно названные “субстратный фон ферментов”. Определение проводили в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносили буфер.

Активность прямых реакций НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле

A[C]xVx106

Г-J-I

где A[C] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах “фермент” и “фон фермента”; V - объем пробы в миллилитрах (0,65); Т - время инкубации (30 мин).

Биолюминесцентное определение активности обратных (НАДН- и НАДФН-зависимых) реакций дегидрогеназ проводили следующим образом: 50 мкл разрушенных лимфоцитов вносили в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат в концентрации 10- -10- М и НАД(Ф)Н в концентрации 10- -10- М при рН 7,0-9,8 в К ,Na -фосфатном или трис-НС1-буфере. После инкубации при 370 С в течение 5 мин к 200 мкл инкубационной смеси добавляли биолюминесцентные реактивы (описаны выше) и проводили измерение свечения на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ-3607. Для определения количества окисленного в ходе дегидрогеназной реакции НАД(Ф)Н параллельно инкубировали контрольную пробу, содержащую те же реактивы, за исключением субстрата, замещенного буфером. Контрольная проба также учитывала окисление НАД(Ф)Н кислородом воздуха. Активность обратных реакций рассчитывали по вышеописанной формуле, где под [С] понимается разница в концентрациях восстановленного кофермента между контрольной и опытной пробами, найденная по калибровочному графику.

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е=1 мкмоль/мин [Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998].

Для получения абсолютных значений активности необходимо построить график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10-9-10-4 М вносили в кювету биохемилюминесцентного анализатора, содержащие биолюминесцентные реактивы в концентрациях указанных выше, после чего производилось измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы [Гительзон И.И. и др., 1984], калибровочные графики строились для каждого рН буфера. На рис. 3.2 представлен пример подобной зависимости.

Воспроизводимость метода оценивали путем определения активности каждого фермента не менее чем в 10 повторах. Ошибка метода не превышала 5%.

Рис. 3.2. Интенсивность биолюминесценции НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредук- тазы-люциферазы в зависимости от концентрации НАД(Ф)Н и рН буфера.




Чувствительность биолюминесцентного метода к восстановленным пиридиннуклеотидам составила 2,0*10" молей НАД(Ф)Н в пробе, что позволяет определять микроколичества НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. При работе с чистыми растворами ферментов чувствительность биолюминесцентного метода достигала 3,0*10-16 Е. рН-Оптимум НАД(Ф)- зависимых дегидрогеназ в реакции по восстановлению кофермента отличен от рН-оптимума работы люминесцентной системы светящихся бактерий (рис. 3.3), в связи с чем нами и была проведена раздельная инкубация.

б

Рис. 3.3. Зависимость интенсивности биолюминесценции (а) и активности некоторых дегидрогеназ от рН среды.

Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в табл. 3.3.

Таким образом, разработан биолюминесцентный метод определения ряда НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови, которые характеризуют основные метаболические процессы в клетках.

Активность окислительно-восстановительных ферментов цикла Кребса, локализующихся в митохондриях, определяет состояние энергетики клетки. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) катализирует дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. СДГ выявляется во всех видах лейкоцитов и бластных элементах костного мозга, а-глицерофосфат дегидрогеназа (аГФДГ) митохондриальная участ-вует в транспорте водорода из гиалоплазмы в митохондрии, осуществляя «челночный механизм», координирующий в клетке процессы дыхания и гликолиза.

Т а б л и ц а 3.3

Концентрация субстратов, кофакторов и показатели рН для определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ биолюминесцентным

методом

Фермент Субстрат Кофактор
Название мМ Название мМ рН буфера
Г6ФДГ Г6Ф 1,5 НАДФ 0,025 9,8
Г3ФДГ Г3Ф 0,5 НАД 0,35 9,8
ЛДГ Лактат 2,0 НАД 0,50 9,0
МДГ Малат 2,0 НАД 2,50 9,8
НАДФМДГ Малат 7,5 НАДФ 0,375 9,8
НАДФГДГ Г лутамат 0,5 НАДФ 1,65 9,8
НАДГДГ Г лутамат 8,7 НАД 8,10 9,8
НАДИЦДГ Изоцитрат 5,0 НАД 5,0 7,8
НАДФИТТДГ Изоцитрат 1,375 НАДФ 0,075 7,4
НАДН-ЛДГ Пируват 0,25 НАДН 0,005 7,0
НАДН-МДГ Оксалоацетат 0,5 НАДН 0,005 7,0
ГР GSH 0,5 НАДФН 0,0025 7,4
НАДФН-ГДГ Оксиглутарат 100 НАДФН 0,0025 7,4
НАДН-ГДГ Оксиглутарат 100 НАДН 0,0025 7,0
Примечание: среды с рН 9,0 и 9,8 готовили на Трис-H Cl-буфере;
с рН 7,0, 7,4 и 7,8 - на К+,Иа+-фосфатном буфере.


Для оценки активности СДГ, аГФДГ и неспецифическая эстераза (НЭ) применяется метод компьютерной морфоденситометрии. Он основан на цифровой обработке изображений, что позволяет объективизировать исследования. Объект исследования характеризуется оптическими и геометрическими признаками. В результате исследования в качестве выходных данных получают морфоденситометрические параметры.

Для проведения измерений сначала вводится изображение, т.е. осуществляется вывод исходного изображения с телевизионной камеры, соединенной с микроскопом, на монитор (рис. 3.4). При этом получается оцифрованное исходное изображение анализируемого препарата - массив чисел, полученный по яркости исходного изображения. Изображение представляется в ЭВМ в виде первичной матрицы распределения интенсивностей. Матрица имеет размерность 256*256 элементов (пиксель). Каждый элемент матрицы представляет собой усредненную на площади 1 пиксель интенсивность. При этом интенсивность каждого ее элемента лежит в пределах от 0 до 255, т.е. всего 256 градаций полутонов серого при


квантовании по интенсивности от 0 - черное до 255 - белое (байт на точ-


Из введенного фрагмента препарата выделяется интересующий объект, т.е. лимфоцит с черными гранулами формазана. В результате последовательного повторения этой операции составляется видеоархив препарата (рис. 3.5).

а б

Рис 3.5. Видеоархивы: лимфоциты с гранулами формазана при реакции на а-глицерофосфатдегидрогеназу (а) и при определении сукцинатдегидрогеназы (б).

Затем проводятся операции, в результате которых одно изображение преобразуется в другое. Возможно преобразование полутонового изображения в оверлейное (бинарное). Оверлейное изображение имеет такую же пространственную размерность, как и само изображение - 256*256, но каждый элемент оверлея может принимать только два значения - 0 или 1 (бит на точку).

На следующем этапе изображение подвергается процессу обработки. К наиболее важным операциям преобразования изображения относятся оцифровывание, кодирование и сжатие данных, улучшение качества и восстановление, сегментация, анализ изображений. Для улучшения качества изображения проводится цифровая фильтрация изображения (включает свыше 20 стандартных фильтров) и редактирование изображения. Результаты некоторых операций представлены на рис. 3.6.

Далее проводятся измерения заданных параметров. Полученные количественные данные сохраняются в файле. После этого на экран дисплея компьютера выводятся данные, содержащие результаты измерения данного объекта. Таким образом, ферментативная реакция оценивается количественно. С помощью камеры Горяева проведена модификация количественных параметров морфологических величин. Нами измерено, что при стандартно используемых характеристиках микроскопа (объектив *100, оптовар *2,5) 1 мм=13 110 пиксель и 1 мм =171 872 100 пиксель . Исходя из этого, морфологические параметры могут быть представлены в метрических величинах.

Рис. 3.6. Последовательный компьютерный анализ активности (по цитохимическому препарату) СДГ лимфоцитов здорового человека.




<< | >>
Источник: Савченко А.А.. Основы клинической иммунометаболомики . Новосибирск: Наука 2012. 2012
Помощь с написанием учебных работ

Еще по теме Изучение метаболизма клеток иммунной системы:

  1. Глава 2. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕАКТИВНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
  2. Метаболические механизмы реактивности клеток иммунной системы
  3. Клинические проявления метаболических нарушений функции клеток иммунной системы
  4. ВАРИАНТЫ ИММУННЫХ ПРОЦЕССОВ С УЧАСТИЕМ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
  5. fi.3.3.4. СИСТЕМЫ, ВЫВОДЯЩИЕ ИЗ КЛЕТОК ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ВЕЩЕСТВА
  6. ТРАНСПОРТНЫЕ СИСТЕМЫ МЕМБРАН КАНАЛЬЦЕВЫХ КЛЕТОК
  7. РЕФЕРАТ. ИЗУЧЕНИЕ СИСТЕМЫ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ В ГОРОДЕ2018, 2018
  8. Иммунная система
  9. ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
  10. Значение оксидоредуктаз в системе внутриклеточного метаболизма
  11. Часть 1. Иммунная система
  12. Глава 13. Иммунная система
  13. Иммунная система и рак
  14. Кишечник и иммунная система
  15. Роль витаминов в системе клеточного метаболизма
  16. ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
  17. Методы исследования иммунной системы
  18. Методы исследования иммунной системы
  19. Краткие сведения о структуре и функциях иммунной системы
  20. Часть 2. Болезни и расстройства иммунной системы