<<
>>

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ А.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОК

Как отмечалось ранее, изучение биосинтеза антибиотиков заключается в установлении реакций, в результате которых продукт первичного метаболизма превращается в молекулу антибиотика. Отправной точкой исследования является, таким образом, выявление «кирпичиков», из которых строится молекула. На этом первоначальном этапе обычно используют изотопные метки. К культуре организма-продуцента добавляют возможные предшественники антибиотика, меченные изотопами 14С, 3Н или 13С; предшественники лучше всего вводить в момент наиболее интенсивного синтеза антибиотика.

По завершении биосинтеза антибиотик экстрагируют, очищают и определяют количество связанного изотопа. Если используется радиоактивная метка, то простой подсчет радиоактивности дает степень включения предшественника. Однако к интерпретации результатов необходимо подходить с большой осторожностью, поскольку 1) предшественник может не поступать в клетку, давая «ложно-отрицательный» ответ, и 2) предшественник может деградировать до более простых молекул, а образовавшиеся фрагменты могут включаться в обычные метаболические пути («ложно-положительный» ответ). Поэтому важно использовать предшественник, специфически меченный по одному или нескольким атомам, и устанавливать путем деградации конечного продукта, включилась ли метка специфически и в какое положение.

Химическая деградация довольно крупных молекул на определенные фрагменты часто оказывается довольно трудной задачей и занимает много времени. Поэтому были предложены другие методы, отличные от радиоизотопных. Наиболее ценный из них —метод с использованием в качестве метки 13С. Природное содержание этого изотопа углерода составляет примерно 1,3/0. С помощью метода ядерного магнитного резонанса

\ (ЯМР), сняв спектр ЯМР данного соединения, можно иденти- ■'-фицировать 13С-атомы по положению соответствующих линий - резонансного поглощения в этом спектре. Если синтезировать предшественники, обогащенные 13С (обогащение может достигать 90%, а многие 13С-предшественники имеются в продаже), добавить их к культуре продуцента и по завершении биосинтеза выделить антибиотик, то включение 13С в конечный продукт можно оценить по увеличению высоты соответствующих пиков в спектре ЯМР. Главная трудность, которая может встретиться при использовании этого метода, состоит в том, что предшественник нельзя добавлять в следовых количествах, как в случае радиоактивной метки, а нужно вводить в субстратных концентрациях. Кроме того, для интерпретации сложных спектров ЯМР нужны специальные знания, опыт и большая экспериментальная работа.

. Б. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЛОК-МУТАНТОВ

Когда предшественник известен, обычно можно высказать разумные предположения относительно путей биосинтеза антибиотика. На этой стадии важно установить хотя бы некоторые промежуточные продукты последовательности реакций, приводящей к образованию конечного продукта. С этой целью обрабатывают организм-продуцент мутагенами и отбирают мутантные штаммы, утратившие способность образовывать антибиотик. Если они появляются в результате единичной мутации, инактивирующей один из ферментов, который участвует в биосинтезе, штамм называют блок-мутантом. Промежуточный продукт, являющийся субстратом блокированной ферментативной реакции, не подвергается дальнейшим превращениям и накапливается в среде. Следовательно, его можно выделить и идентифицировать. Для доказательства того, что данное соединение действительно является промежуточным продуктом биосинтети

блокированными по двум разным участкам биосинтетического пути. Неспособность одного из них синтезировать промежуточный продукт компенсируется способностью другого накапливать его.

В. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Использование радиоизотопных методов и идентификация промежуточных продуктов обычно позволяют определить последовательность реакций, приводящих к. синтезу антибиотика. Эту последовательность, однако, нельзя считать окончательно установленной до тех пор, пока не показано, что микроорганизм обладает ферментами, способными катализировать отдельные реакции последовательности. Этот вопрос изучают с помощью обычных биохимических методов. Исследуют ферментативную активность бесклеточных систем, по возможности фермент очищают и определяют его свойства. При образовании семейств антибиотиков бывает целесообразно определить субстратную специфичность фермента. Для подтверждения роли фермента часто устанавливают его наличие и отсутствие у образующих и не образующих антибиотика вариантов микроорганизма. Очевидно, что описанный здесь ход исследований является некой идеализацией. На самом деле ключом к установлению пути биосинтеза может оказаться идентификация определенной ферментативной активности еще до того, как получены какие-либо промежуточные продукты. Часто промежуточные продукты очень легко выделяются из штаммов, полученных в результате обработки продуцентов мутагенами с целью повышения их активности. Однако все сложные биосинтетические пути, установленные в последние годы, были идентифицированы в результате комбинированного использования всех методов, представленных выше.

III.

<< | >>
Источник: Дланчини Д., Паренти. Антибиотики. Пер. с англ. — М.: Мир,1985. — 272 с., ил.. 1985

Еще по теме МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ А.:

  1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  4. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  6. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  7. Распространенные методы исследований
  8. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ДЫХАНИЯ
  9. Методы исследования иммунной системы
  10. Специальные методы исследования
  11. ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ