Определение 4-пиридоксиловой кислоты в моче по Хуффу и Перлцвейгу

Принцип метода. Методика определения 4-пиридоксиловой кислоты основана на ее превращении в результате гидролиза в лактонную фор

му, максимум флюоресценции которой проявляется в щелочной среде при рН 9,0-10,0.

Реактивы.

1. Синтетический лактон 4-пиридоксиловой кислоты.

2. 0,6 М раствор соляной кислоты: концентрированную кислоту с относительной плотностью 1,26 разводят дистиллированной водой в соотношении 1:10.

3. 0,1 М раствор соляной кислоты.

4. Тетраборат натрия (бура кристаллическая, Na4B407 * 10 Н2О), х.ч.

5. Индикатор универсальный.

6. Приготовление основного стандартного раствора: 4 мг кристаллического лактона 4-пиридоксиловой кислоты вносят в мерную колбу на 100 мл и растворяют в небольшом объеме 0,1 М раствора соляной кислоты, доводят объем до метки 0,1 М раствором соляной кислоты. В 1 мл основного стандартного раствора содержится 40 мкг лактона 4- пиридоксиловой кислоты. Раствор хранят в холодильнике в запарафи- нированной посуде из темного стекла, пригоден для работы в течение 5 - 6 мес.

7. Рабочий стандартный раствор готовят из основного: в мерную колбу на 100 мл микропипеткой отмеривают 0,2 мл основного стандартного раствора, туда же приливают в небольшом количестве (приблизительно 10 мл) 0,1 М раствор соляной кислоты, объем доводят дистиллированной водой до метки. В 1 мл рабочего стандартного раствора содержится 0,008 мг лактона 4-пиридоксиловой кислоты. Рабочий стандартный раствор готовят в день выполнения исследования, при хранении в холодильнике пригоден в течение 4-5 дней.

8. Г отовят стандарты с содержанием 0,04 и 0,08 мкг лактона, для чего берут соответственно 5 и 10 мл рабочего стандартного раствора, вливают в две фарфоровые чашечки. В первую, куда добавлено 5 мл рабочего стандартного раствора, приливают 5 мл дистиллированной воды (доводят объем до 10 мл). Применяя кристаллическую буру, которую добавляют небольшими порциями и растирают в чашечках стеклянной палочкой, производят нейтрализацию, проверяя рН по универсальному индикатору, доводят рН до 9-10, о чем свидетельствует изменение окраски индикатора до сине-зеленого оттенка. Контролем к стандарту служит дистиллированная вода, к 1 мл которой добавляют 9 мл 0,6 М раствора соляной кислоты. Приготовленной шкалой можно пользоваться в течение недели, сохраняя стандартный раствор в холодильнике в закупоренной пробирке.

Ход определения.

В химическую пробирку вносят 1 мл мочи, добавляют 9 мл 0,6 М раствора соляной кислоты (опыт), перемешивают и отбирают 1 мл разведенной мочи в другую пробирку (контроль).

Опытную пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 мин для гидролиза, в результате которого образуется лактон 4-пиридоксиловой кислоты.

Вынимают из бани, охлаждают и отбирают 1 мл в чистую сухую пробирку (опыт).

В обе пробирки (опыт и контроль) добавляют по 9 мл дистиллированной воды, перемешивают.

Отбирают по 1 мл разведенной мочи (из опытной и контрольной проб) и переносят в фарфоровые чашечки, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой.

В фарфоровые чашечки глазной палочкой добавляют кристаллическую буру (1-2 порции), растирают стеклянной палочкой до полного растворения.

С помощью универсального индикатора, капли которого наносят на фарфоровую пластинку, проверяют рН исследуемых проб мочи. После нейтрализации и подщелачивания мочи до необходимого значения рН (рН 9-10) окраска индикатора изменяется до сине-зеленого оттенка.

Содержимое чашечек (как исследуемых проб, так и стандарта) сливают в чистые химические пробирки таким образом, чтобы в пробирки не попали оставшиеся кристаллики буры.

По стандартному раствору калибруют прибор так, чтобы показания гальванометра равнялись 20 или 40 делениям. Затем сравнивают флюоресценцию опытной и контрольной проб со стандартным раствором.

Расчет количества выделенной с мочой 4-пиридоксиловой кислоты производят по формуле:

Tjr 0,08 х (О - К) xV х 1,109

X = —--- ^^—, где

0,01 х 40 - Кст

X - количество выделенной за сутки 4-пиридоксиловой кислоты, мг;

V - суточный объем мочи, мл;

О - показание флюориметра для опытной пробы;

К - показание флюориметра для контрольной пробы;

0, 08 - концентрация лактона в стандарте, мкг/мл;

0, 01 - объем мочи, взятой для исследования, мл;

40 - установленное показание для стандарта на шкале флюориметра;

Кст - показание флюориметра для контроля к стандарту;

1,109 - коэффициент пересчета лактона 4-пиридоксиловой кислоты в 4- пиридоксиловую кислоту.

Коэффициент для перевода содержания 4-пиридоксиловой кислоты в моче из мг/сут в мкмоль/сут - 5,91.

Норма экскреции 4-пиридоксиловой кислоты за сутки: 4,73-14,8 мкмоль (0,8-2,5 мг); часовая натощак: 0,29-0,35 мкмоль (50-60 мкг).